大規模混合ステージ カエノハブディティス・エレガンス集団の 文化とアッセイ

1. LSCPおよび機器の殺菌 手洗いでガラスLSCを準備し、食器洗い、その後のオートクレーブ処理を行い、実験を開始する前にガラス製品に汚染物質がないことを確認します。オートクレーブLSCは、使用されるまで清潔な乾燥した場所に保管してください。注: LSC が食器洗い機とオートクレーブの安全であることを確認してください。LSCPの蓋が食器洗い機の安全であることを確認してください。 手洗いの後に食器洗いでLSCPのふたを準備します。LSCPの蓋は必要になるまで清潔なビンに保管してください。 ネマトード成長培地アガロース(NGMA)が準備された日に、LSCPの蓋を10%漂白剤溶液で2回拭き取り、その後70%エタノールを加えます。10%の漂白剤と70%のエタノールで拭き取ったら、NGMAが準備される層流フードのきれいなビンにLSCPのふたを保管してください。 2. 線虫増殖培地アガロース(NGMA)の準備 攪拌板に攪拌棒を持つオートクレーブ2 Lエルレンマイヤーフラスコに以下の試薬を組み合わせてNGMAを調製する:2.5gペプトン、3 g NaCl、7 gアガロース、10g寒天、および975 mL滅菌水16。総体積が1 Lに等しいことを確認します。注: ここで説明する NGMA の準備手順は、2.5 LsPS のための十分な材料を生成します。プロトコルは、特定の実験で必要な LSCP バッチ サイズに合わせて調整できます。 121°Cで液体サイクルのオートクレーブ、45分間の午後21時。 水浴をオンにし、50°Cに設定します。 オートクレーブしたNGMAを水浴に持ち込み、50°Cに冷却します。 ボンネットまたはクリーニングされたスペースにNGMAの2 Lエルレンマイヤーフラスコを持参し、攪拌板にセットします。NGMA温度を追跡するには、温度計を使用します。 NGMAが50°Cに達した後、 フード内または洗浄されたスペースの中に無菌使い捨てピペットを記載した順序で以下を追加します:1 M KH2PO4(Kリン酸バッファー)の25 mL、コレステロール1 mL(エタノール中5mg/mL)、1 mLの 1 M CaCl2,1 M MgSO4の 1 mL, 1 mL のナイスタチン (10 mg/mL), ストレプトマイシン 1 mL (100 mg/mL)16. 約1.3cmの深さの無菌ガラスLSCPに400 mLのNGMAを注ぎ込み、LSCPがボンネットの平らな表面に固まり、オートクレーブされたホイルの蓋をLSCPに戻します。 寒天をセットしたら、ホイルを取り外し、LSCPにきれいな気密蓋を置き、4°Cに移動して保管します。使用されるまで4°CでLSCにNGMAを保存し、5日以内に使用します。 3. LSCP で NGMA 用 大腸菌 食品を生成する 安定した食料源を生成するために、中央限界定理17と一致する小さなバッチ平均化概念を用いてHT115(DE3)大腸菌のバッチを生成する。-80°Cで保管してください。 必要に応じて、大腸菌のストックを-80°Cから解凍18に引っ張ります。注:このプロトコルでは、大腸菌の細菌ストックはバイオリアクターで栽培されました。培養の成長の終わりに、培養を1:50希釈し、測定されたOD600は0.4であった。したがって、培養物は20の有効OD600を持っていた。細菌をペレット化し、秤量し、0.5g/mL(湿潤重量)の濃度でK培地中に再懸濁し、2mLアリコートに移し、凍結19. 4. NGMAのバクテリア芝生 NGMA LSCP を室温 (RT) に 4 °C から数時間持ち込み、細菌の芝生を広げ、LSCP 全体が RT に到達できるようにします。 必要な 大腸菌 ストックを-80°Cから解凍18に引き出す。 希薄な 大腸菌 の細菌ストック(複数可)と2 mLの無菌K培地を有し、NGMA LSCP当たり4mLで0.5g の大腸菌 を達成する。NGMA LSCPの中央に大 腸菌 のピペット4 mLを慎重に。 無菌スプレッダーを使用して、NGMA 大腸菌 の縁の周りに約3.8cmの部屋を残して長方形に細菌を広げます。 ボンネットに 大腸菌 を入れたNGMA LSCPをファンに1時間入れて、 大腸菌 懸濁液が完全に乾燥するようにします。 バクテリアの芝生が乾いたら、蓋をしっかりと押し、使用するまで4°Cで保管します。 5. チャンクワームは、サンプル間のストレスと年齢変動を軽減します 冷凍ワームストックから新たに播種された6 cmプレート4にストリークワーム。このプレートは「マスターチャンク」プレートとして機能します。注:チャンキングは、ホモ接合株20からワームを転送するための最適な方法です。ひずみがヘテロ接合である場合、またはピッキングと交配によって維持する必要がある場合、チャンクは推奨されません。使用するワーム遺伝子型、成長のために選択された温度、および下流のステップに応じて、チャンク周波数を最適化する必要があります。 マスターチャンクプレートが健康なグラビッド大人(約3日間)でいっぱいで、大 腸菌 の芝生がまだたくさん残った後、WormBookで説明されているように標準的な C.エレガンス チャンキングガイドラインに従って4つの合計チャンクプレートを生成する。 成長のために特に指定されていない限り、すべてのチャンクプレートを20°Cの制御温度(CT)室に保管してください。注:このプロトコルのユーザーがここで説明するようにCT室にアクセスできない場合は、温度を制御できる小さなインキュベーターまたは環境条件を可能な限り制御できる指定された部屋のいずれかを使用することをお勧めします。これらの代替オプションがどちらも使用できない場合は、サンプルの増加の変動が大きくなる可能性があることに注意してください。 多くのグラビッドの成人が4番目 のチャンクプレートで観察されたら、ステップ6に進みます。 6. LSCPにグレーブの大人を漂白スポット 注:この漂白技術は、ほとんどの汚染物質を根絶し、成虫から胚を放出する雌雄同体のキューティクルを溶解するために使用されます。漂白剤溶液は、胚が孵化する前にNGMAに浸漬する。 漂白ワームを発見する前に、LSCPsを数時間RTに持ち出します。 ddH 2 O:漂白剤:5 M NaOHの7:2:1比を準備します。このアルカリ性次亜塩素酸溶液を使用直前に新鮮にします。注: 漂白剤バッチが影響を受けないように、特定の実験の期間中、同じ漂白剤と NaOH を使用します。このプロトコルで使用される漂白剤は、5-10%次亜塩素酸ナトリウムであった。 ブンゼンバーナーに火をつけて、続行する前にワームピックを炎上します。LSCPの細菌の芝生の端から無菌ピックに新鮮な 大腸菌 をすくいます。 スポット漂白のための4番目 のチャンクプレートから単一のグラビッド大人を選びます。 アルカリ次亜塩素酸溶液のピペット5 μLを大 腸菌 の芝生から離れたLSCPの一角に取り込んだ。 選んだグラビッドの大人を5μLのアルカリ性次亜塩素酸溶液に入れる。線虫をタップしてキューティクルを破壊し、卵を放出させます。 ステップ 6.4 ~ 6.6 を合計 4 倍に繰り返し、5 人の大人を 大腸菌 の芝生の周りに均等に配置します。ほぼ遺伝的に同位体の個体が所定のサンプルに追加されることを確実にするために、同じ4番目 のチャンクプレートからすべての5人のグラビッド成人を選んでください。 蓋を LSCP に戻します。 すべての LSC に対して手順を繰り返します。 7. 制御温度(CT)室でのワームの成長 スポット漂白に続いて、蓋をLSCPにしっかりと置き、一定の気流と12L:12D光周期(12時間光と12時間の暗闇)で20°Cに設定されたCTルームに置きます。 CT室にサンプルを置いた時間と位置に注意してください。注: 部屋の中の位置は、成長中に発生する可能性のあるサンプルが発生する可能性のある環境の違いを記録するために、常に文書化する必要があります。サンプルが CT ルームに入ると、割り当てられた場所に邪魔されずに残る必要があります。汚染の可能性を減らすには、CT室でLSCPの蓋を開けないでください。 LSCPを顕微鏡に持って行き、CT室の外で、人口増加と密度を観察する。注:各 C.エレガン株 とサンプルは成長が異なるので、サンプルを注意深く監視してください。CT室でLSCPの成長を妨げないことを推奨するが、LSCPはCT室から輸送され、蓋はサンプルの成長を監視するために2日ごとに開いた。2 日ごとに密封されたカバーを LSCP から取り出す場合も、O2 が LSCP に流れ込みます。 収穫前にLSCPがワームの大量の集団でいっぱいになっていることを確認してください。LSCP を収集する準備ができているかどうかを判断するには、次の基準を使用します。 LSCP が、大人のワームでいっぱいであることを確認します。 プレートに大きな母集団が含まれていることを確認します (すなわち、 ワームは寒天の表面全体を覆います)。 プレートが寒天の表面に多くの卵を持たないようにしてください(すなわち、ワームの最大数が孵化しているはずです)。 プレートが残っている大 腸菌 が最小限に抑えられるようにし、さらに2日間プレートに放置すると、ワームが飢えてダウアー幼虫を生成することを示します。注: ほとんどの LSCP は、ひずみとサンプルに応じて 10 ~ 20 日の間に収穫する準備ができていますが、このプロトコルを確立する際に各 LSCP を頻繁にチェックして、通常の収穫時間を決定します。 SSP間の取り扱い間の70%エタノールを用いる手袋および区域は、株間の交差汚染を避ける。 8. LSCP サンプルの収穫 サンプルを収穫する前に、オンにして遠心分離機を4°Cに冷却します。 収穫されるLSCPあたりのM9の解決の50 mLの3つの50 mLの円錐形の管を準備する。 LSCP ごとに 15 mL 円錐管にラベルを付けます。注:ワームはこれらの管にペレットを十分にする傾向があるので、すべての遠心分離のステップは、15 mL円錐管で行われます。 50 mL の M9 溶液(ステップ 8.2 の 50 mL 円錐管から)を LSCP 表面に注ぎ、旋回して M9 が NGMA 表面全体をカバーするようにします。 M9はLSCP表面に座っているが、M9と無菌血清学的ピペットをプライム。注:M9で無菌血清ピペットをプライミングすることにより、これはより少ないワームがプラスチックピペットの内側に付着し、サンプルの損失を防ぐことを保証します。 LSCP を傾けて M9 とワームの集団が LSCP の一角に集まるようにします。注: M9 ソリューションと LSCP からのワームの混合は、ダウンストリーム の手順では”ワームの中断”と呼ばれます。 自動ピペット、ピペットワームサスペンションとプライミングされた血清学的ピペットを使用して、元の50 mL円錐形チューブに配置します。50 mLのワーム懸濁液が回収されたら、円錐形のチューブをロッカーに置き、細菌の塊や破片を破壊します。 LSCP あたり 150 mL のワーム懸濁液を収集する手順 8.4 ~ 8.7 を繰り返します。 ワーム懸濁液の15 mLを、3つの50 mL円錐管のうちの1つから、ステップ8.3で脇に置かれたラベル付き15 mL円錐管に注ぎ込む。遠心分離器は、15 mL円錐管を884 x g で4°Cで1分間用いた。 ワームの大部分は、チューブの下部にペレットになります。 上清を吸引し、虫ペレットを乱さないことを保証する。 同じ15 mLの円錐管に約13 mLのワームサスペンションを加え続け、150 mLのワームサスペンションがすべて消費されるまで、同じ15 mLの円錐管の繰り返し手順8.9と8.10を繰り返します。チューブを反転し、遠心分離の間のペレットを邪魔し、できるだけ多くの細菌や破片を洗い流し、吸引します。注:このステップでは、3つの50 mL円錐形の管の内容物は単一の15 mLの管で凝縮される。 15 mL円錐形チューブに10mLのクリーンM9を加え、反転してワームペレットを攪拌します。遠心分離器は、15 mL円錐管を884 x g で4°Cで1分間用いた。 上清を吸引し、虫ペレットを乱さないことを保証する。2 回繰り返します。注:サンプルに大量の破片や細菌が含まれる場合は、サンプルがきれいになるまでステップ8.12を繰り返します。 サンプルがクリーンになったら、ワームペレットにddH2Oを加え、合計10 mLのddH2Oとワームを加えます。逆にしてワームペレットを攪拌する。ドモティックストレスを避けるために、ワームは5分以下の間ddH2Oに留まる必要がありますので、ステップ9.1に素早く移動します。注: ddH2O でのウォームペレットのサスペンドは、下流 -omics ステップに推奨される溶媒です。ワームは、特定の実験ワークフローと互換性がある場合、他の溶媒またはバッファに懸濁させることができます。 9. 人口規模の見積もり 注:ステップ9.1から9.7を素早く進んでください。ステップ 8.13 からの ddH2O とワームの混合は、以降のステップで「ワームサンプル」と呼ばれます。 ワームサンプルをピペット化する前に、M9と一緒に使用するプライムピペットチップは、プラスチックピペットの内側に付着するワームがサンプル損失を防止し、カウントの変動を低減することを避けます。 100 μL のワームサンプルのアリコートを取り、M9 の 900 μL に希釈します。よく混ぜて、連続希釈を行います (1:10, 1:100, 1:1000).このステップを 2 回繰り返して、合計 3 組のアリコート複製を達成します。注: ピペットワームは、サンプルの母集団数に大きく変動を引き起こす可能性があります。望ましいアリコートをピペット化する前に、ワームサンプルが均質であることを確認してください。 アリコートがカウントされている間、移動培養を続けるためにロッカーの15 mL円錐管をセットします。 ワームサンプルが十分に混合され、均質であることを確認します。1:10ワームサンプルからピペット5μL、顕微鏡スライドに分配し、ワームの数を数えます。この数が約 50 個未満の場合は、1:100 と 1:1000 の希釈もカウントします。50 を超える場合は、次のシリアル希釈に移動します。注: 多数のワームを正確にカウントできない場合は、代わりに次のシリアル希釈を使用してください。 各希釈3xの各アリコート複製をカウントする。カウントの最後に、ほとんどのカルチャで、合計 9 個のカウントが文書化されます (つまり、各アリコートレプリケートの合計カウント数は 3です)。 希釈数を平均して、ワームサンプルの推定母集団サイズを決定します。これらの希釈数は、-omicsステップに必要なアリコートサイズを作成するために必要なワームサンプルの量を決定します。注: この実験では、約 200,000 個の混合ステージワームのアリコートが生成されました。さらに、約50,000の混合ステージワームの1つのアリコートを、大粒子フローサイトメーターでの選別のために確保した(ステップ10で説明)。 ワームサンプルが適切なアリコートに分割されたら、液体窒素でフラッシュフリーズし、サンプルを-80°Cで保存します。注: 大きなパーティクル フロー サイトメトリーを対象としたアリコートをフリーズしないでください。 10. (オプション) 大粒子フローサイトメトリー用のサンプルを準備する 注: ステップ 10、 11、 および 12 は、サンプルの成長を記録する著者の好ましい方法 (すなわち、C. elegansライフサイクル段階の母集団サイズと母集団分布) と、文化の成功を決定する方法です。このプロトコルのユーザーは、オプションのステップ 10、11、および 12 を、成長成功の独自のメトリックに置き換えることができます。手順 10、11、および 12 は、2 つの理由からここに説明されています。第 1 に、手順 10、11、および 12 で使用される機器を持つユーザーは、これらの手順を複製して、2 番目にこの拡張方法の検証を示すことができます。上記のステップ9は、アリコートサイズを決定するためのワームの総数を適切に推定し、ステップ10は、特定のサンプル内のワームの数と集団分布を推定するためのより定量的なメトリックです。 M9ソリューションで約50,000個の混合ステージワーム(ステップ9.6に取っておいたもの)のアリコートを最大10 mLの総量に持って来てください。 1 mg/mLの 大腸菌 と0.5 μM赤色蛍光微小球の1:50希釈液で構成される溶液を作る。 M9の混合ステージワームの10 mLにこの溶液の200 μLを加え、20分間揺れながらインキュベートします。 20分後、15 mL円錐管を884 x g で4°Cで1分間遠心分離する。 上清を吸引し、虫ペレットを乱さないことを保証する。 M9溶液でワームペレットを2回洗浄し、過剰な細菌や赤色蛍光微小球を除去します。 M9の5 mLをワームペレットに加え、ペレットがきれいに見えるようにします。ペレットがきれいであれば、M9の5 mLを50 mMのアジドナトリウムをストレートに加え、ワームを殺して正確なカウントとサイジング21を行います。 アジドナトリウムがサンプルに追加された日時を文書化します。 大きな粒子フローサイトメトリーに必要になるまで、サンプルをロッカーに置きます。注:アジドナトリウムは線虫類生理学(すなわち、体長、代謝、および耐熱性)に影響を与える知られている。したがって、これらの生理学的影響の多くが数分22の範囲内で起こるので、ワームがアジ化ナトリウムにさらされる時間に注意することが重要である。ワームに対するアジドナトリウムの既知の生理学的効果のために、この治療は下流の画像品質に影響を与え、考慮する必要があります。 11. (オプション) 人口分布を文書化し、イメージング用の384ウェルプレートを準備する 注: ステップ 11 では、大きなパーティクル フロー サイトメーター(LPFC)を使用します。LPFCの基本的な知識は、このプロトコルで想定されます。他の方法は、サンプルの成長と母集団分布を文書化するために置き換えることができます。ここで説明する手順は、パイプライン23で LPFC を使用する予定のユーザーを対象としています。 LPFCの電源を入れ、きれいにしてプライムし、サンプルを選別する前にレーザーを1時間温めます。 レーザーが温まったら、”ヒストグラム” プロファイルを開き、2050 年の飛行時間 (TOF) にスケールします。 TOF 範囲 100 の 「ヒストグラム」にバー領域を追加します。最初のバー領域は、50-150のTOFをカバーしています。 100 の TOF 範囲にまたがる 20 のバー領域を作成し続けます。これらのバー領域は、TOF 範囲全体に 50 ~ 2050 の範囲をまたがります。TOF 分布全体で使用する正確なゲート領域については、 補足表 1 を参照してください。 このヒストグラムを”実験”として保存し、将来の LPFC 実行で使用します。 校正された384ウェルプレートを選択するか、計器を384ウェルプレートにキャリブレーションして、オブジェクトを分配します。 キャリブレーションされた384ウェルプレートテンプレートに入ると、ステップ11.3-4で作成された20のバー領域のそれぞれに対して、20個のゲートオブジェクトを4つの井戸(各ゲート領域の4つの技術的複製)に分配するテンプレートを設定します。384 ウェル プレートにワームを分配する方法の例のレイアウトについては 、補足表 2 を参照してください。 ステップ10.9から50 mLの円錐管にサンプルを移し、M9ソリューションを追加して、約40 mLの総容積を達成します。 ステップ11.7で設定されたパラメータごとにサンプルを自動的にソートし、サンプルを沈降させ、同時にサンプルからキャリブレーションされた384ウェルプレートにオブジェクトを分配するのを防ぎます。注: LPFC の流量が毎秒 15 ~ 20 オブジェクトの間で動作していることを確認し、並べ替える倍数を指定しないようにします。 サンプル全体をソートし、ゲート領域の最大数を384ウェルプレートに分配したら、LPFCからサンプルを取り出し、きれいな器具を取り出します。注: より大きな TOF 領域に達すると、その TOF 領域のイベント数が少ないため、384 ウェル プレートを埋め続けるのが困難になる場合があります。できるだけ多くのゲート領域を埋め、サンプルが不足する前に C.エレガンス のライフステージがLPFC分布内のどこに入るのかを最もよく知ることができます。 384ウェルプレートの上にシーリングフィルムを置き、画像化します。注:サンプルはアジドナトリウム22で処理されるため、ソート後できるだけ早くイメージプレート。赤色蛍光微小球は、各ソートされたオブジェクトに放出される赤色蛍光のレベルに基づいて収集されたLPFCデータファイル(出力 テキストファイルのPHレッドデータ)に見られ、どの物体が生きているワーム、死んだワーム、ダウアー、またはジャンク24を識別するのに役立ちます。 12. (オプション) イメージング 384 ウェルプレート 注:ステップ12は、プレート読み取りマイクロ共焦点顕微鏡を使用します。このプロトコルでは、マイクロ共焦点顕微鏡の基礎知識が前提とされている。他の方法は、サンプルの成長と母集団分布を文書化するために置き換えることができます。 20xレンズを用いたプレート読み取りマイクロ共焦点顕微鏡を使用。 [目標とカメラ] タブを開き、”10xプラン ApoLambda”モードに設定します。 [カメラビニング] タブを開き、 “2” に設定します。 [サイトをプレートに表示]タブを開き、ウェルごとに”4″サイトと “オーバーラップ サイト 10%”に設定すると、後で画像をつなぎ合わせます。 「波長」タブを開き、「ブライトフィールド1」に設定します。 「イルミネーション」タブを開き、「透過光、明るいサンプル」に設定します。 384 ウェル プレートを顕微鏡に配置し、”Z スタック” を [オフセットの計算] に設定し、384 ウェル プレートのサンプルに適した焦点面を見つけます。 マイクロ共焦点顕微鏡で384ウェルプレートを実行し、ウェルごとに4つの画像を収集します。 4つの画像を一緒にモンタージュして、井戸ごとに1つの画像を作成します。