Kultur und Assay von großflächigen Caenorhabditis elegans-Populationen im gemischten Stadium

1. LSCP und Ausrüstung sterilisieren Bereiten Sie Glas-LSCPs durch Händewaschen, gefolgt von Geschirrspülen und anschließendem Autoklavieren vor, um sicherzustellen, dass Glaswaren frei von Verunreinigungen sind, bevor Sie mit dem Experiment beginnen. Lagern Sie autoklavierte LSCPs an einem sauberen, trockenen Ort, bis sie verwendet werden.HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass LSCPs spülmaschinen- und autoklavsicher sind. Stellen Sie sicher, dass die LSCP-Deckel spülmaschinenfest sind. LSCP-Deckel durch Handwaschen mit anschließendem Geschirrspülen zubereiten. Lagern Sie LSCP-Deckel in einem sauberen Behälter, bis sie benötigt werden. An dem Tag, an dem Nematode Growth Media Agarose (NGMA) vorbereitet wird, wischen Sie die LSCP-Deckel zweimal mit 10% Bleichlösung ab, gefolgt von 70% Ethanol. Nach dem Abwischen mit 10% Bleichmittel und 70% Ethanol die LSCP-Deckel in einem sauberen Behälter in der Laminar-Flow-Haube aufbewahren, wo der NGMA vorbereitet wird. 2. Nematoden-Wachstumsmedien Agarose (NGMA) vorbereiten NGMA zubereiten, indem die folgenden Reagenzien zu einem autoklavierten 2 L Erlenmeyerkolben mit Rührstab auf einer Rührplatte kombiniert werden: 2,5 g Pepton, 3 g NaCl, 7 g Agarose, 10 g Agar und 975 ml steriles Wasser16. Stellen Sie sicher, dass das Gesamtvolumen 1 L entspricht. Kleben Sie eine Folienkappe auf den Kolben.HINWEIS: Die hier beschriebenen Vorbereitungsschritte für die NGMA ergeben genügend Material für 2,5 LSCPs. Das Protokoll kann auf die benötigte LSCP-Losgröße in einem bestimmten Experiment zugeschnitten werden. Autoklav im Flüssigkeitskreislauf bei 121 °C und 21 p.s.i. für 45 min. Schalten Sie das Wasserbad ein und stellen Sie es auf 50 °C ein. Bringen Sie das autoklavierte NGMA ins Wasserbad, um es auf 50 °C abzukühlen. 2 L Erlenmeyerkolben NGMA in die Haube oder den gereinigten Raum geben und auf eine Rührplatte stellen. Verwenden Sie ein Thermometer, um die NGMA-Temperatur zu verfolgen. Nachdem die NGMA 50 °C erreicht hat, fügen Sie Folgendes in der mit einer sterilen Einwegpipette in der Haube oder im gereinigten Raum aufgeführten Reihenfolge hinzu: 25 ml 1 M KH2PO4 (K-Phosphatpuffer), 1 ml Cholesterin (5 mg/ml ethanol), 1 ml 1 M CaCl2,1 ml 1 M MgSO4,1 ml Nystatin (10 mg/ml) und 1 ml Streptomycin (100 mg/ml)16. Gießen Sie 400 ml NGMA in ein steriles Glas LSCP, etwa 1,3 cm tief, lassen Sie das LSCP auf einer ebenen Oberfläche in der Haube erarren und legen Sie den autoklavierten Foliendeckel wieder auf den LSCP. Sobald das Agar eingestellt ist, entfernen Sie die Folie, legen Sie einen sauberen, luftdichten Deckel auf LSCP und bewegen Sie sich zur Lagerung auf 4 ° C. Lagern Sie NGMA in LSCPs bei 4 °C bis zur Verwendung und Verwendung innerhalb von 5 Tagen. 3. Generieren Sie E. coli-Lebensmittel für NGMA auf LSCP Um eine stabile Nahrungsquelle zu erzeugen, erzeugen Sie Chargen von HT115 (DE3) E. coli unter Verwendung eines Kleinchargenmittelungskonzepts, das mit dem zentralenGrenzwertsatz 17übereinstimmt. Bei -80 °C lagern. Bei Bedarf E. coli Bakterienbestand(e) von -80 °C bis18auftauen.HINWEIS: In diesem Protokoll wurden E. coli-Bakterienbestände in einem Bioreaktor gezüchtet. Am Ende des Kulturwachstums wurde die Kultur um 1:50 verdünnt und der gemessene OD600 betrug 0,4. Somit hatte die Kultur einen effektiven OD600 von 20. Bakterien wurden in einer Konzentration von 0,5 g/ml (Nassgewicht) in K-Medium pelletiert, gewogen und resuspendiert, in 2-ml-Aliquoten überführt und19eingefroren. 4. Bakterienwiese auf NGMA Bringen Sie NGMA LSCPs aus 4 °C für mehrere Stunden auf Raumtemperatur (RT), bevor Sie den Bakterien rasen verteilen, damit das gesamte LSCP RT erreichen kann. Ziehen Sie die benötigten E. coli-Bakterienbestände von -80 °C bis zum Auftauenvon 18° C heraus. Verdünnen Sie E. coli-Bakterienvorräte mit 2 ml sterilem K-Medium, um 0,5 g E. coli in 4 ml pro NGMA LSCP zu erreichen. 4 ml E. coli in der Mitte des NGMA LSCP vorsichtig pipetten. Verwenden Sie einen sterilen Streuer, um Bakterien in ein Rechteck zu verteilen, so dass etwa 3,8 cm Platz an den Rändern des NGMA E. coli frei bleiben. Lassen Sie den NGMA LSCP mit E. coli in der Motorhaube mit eingeschalteter Lüfter für 1 h, um sicherzustellen, dass die E. coli-Aufhängung vollständig trocknet. Sobald der Bakterien rasen trocken ist, drücken Sie den Deckel fest auf und lagern Sie ihn bei 4 °C, bis er verwendet ist. 5. Chunk Würmer, um Stress und Altersvariabilität zwischen den Proben zu reduzieren Streifen sie Würmer von einem gefrorenen Wurmstock zu einem neu ausgesäten 6 cm Teller4. Diese Platte dient als “Master Chunk” -Platte.HINWEIS: Chunking ist eine optimale Methode, um Würmer aus einem homozygoten Stamm20zu übertragen. Wenn ein Stamm heterozygot ist oder durch Pflücken und Paarung aufrechterhalten werden muss, ist ein Chunking nicht ratsam. Die Chunking-Häufigkeit muss möglicherweise optimiert werden, abhängig von den verwendeten Wurmgenotypen, der für das Wachstum gewählten Temperatur und den nachgelagerten Schritten. Nachdem die Master-Chunk-Platte voll von gesunden graviden Erwachsenen (ca. 3 Tage) ist und noch viel E. coli-Rasen vorhanden ist, befolgen Sie die Standard-C. elegans-Chunking-Richtlinien, wie in WormBook beschrieben, um vier Gesamt-Chunk-Platten zu produzieren4. Lagern Sie alle Stückplatten in einem Raum mit kontrollierter Temperatur (CT) bei 20 °C, sofern nicht anders für das Wachstum angegeben.HINWEIS: Wenn Benutzer dieses Protokolls keinen Zugang zu einem CT-Raum haben, wie hier beschrieben, wird empfohlen, entweder einen kleinen Inkubator zu verwenden, in dem die Temperatur kontrolliert werden kann, oder einen dafür vorgesehenen Raum, in dem die Umgebungsbedingungen so weit wie möglich kontrolliert werden können. Wenn keine dieser alternativen Optionen verfügbar ist, beachten Sie, dass die Variation des Probenwachstums größer sein kann. Sobald viele gravidierte Erwachsene in der4. Brockenplatte beobachtet wurden, fahren Sie mit Schritt 6 fort. 6. Spot Bleichen gravider Erwachsener auf LSCP HINWEIS: Diese Bleichtechnik wird verwendet, um die meisten Verunreinigungen zu beseitigen und die Nagelhaut der Hermaphroditen aufzulösen, die Embryonen aus dem erwachsenen Wurm freisetzen. Die Bleichlösung wird vor dem Schlüpfen der Embryonen in das NGMA einweichen. Bringen Sie LSCPs für mehrere Stunden auf RT, bevor Sie Bleichwürmer entdecken. Bereiten Sie ein 7: 2: 1 Verhältnis von ddH2O : Bleichmittel : 5 M NaOH vor. Machen Sie diese alkalische Hypochloritlösung kurz vor dem Gebrauch frisch.HINWEIS: Verwenden Sie während der gesamten Dauer eines bestimmten Experiments den gleichen Vorrat an Bleichmittel und NaOH, um Auswirkungen auf Bleichmittelchargen zu vermeiden. Bleichmittel, das in diesem Protokoll verwendet wurde, war 5-10% Natriumhypochlorit. Zünden Sie einen Bunsenbrenner an und flammen Sie einen Wurmpickel an, bevor Sie fortfahren. Frische E. coli vom Rand des Bakterien rasens auf dem LSCP auf einen sterilen Pickel schöpfen. Wählen Sie einen einzelnen graviden Erwachsenen aus der4. Brockenplatte für spot bleaching. 5 μL der alkalischen Hypochloritlösung in eine Ecke des LSCP weg vom E. coli-Rasen pipetten. Den gepflückten gravidierten Erwachsenen in die 5 μL alkalische Hypochloritlösung geben. Tippen Sie auf den Fadenwurm, um die Nagelhaut zu stören und Eier freizusetzen. Wiederholen Sie die Schritte 6.4 – 6.6 für insgesamt 4x und legen Sie 5 gravid Erwachsene gleichmäßig um den E. coli Rasen. Wählen Sie alle 5 graviden Erwachsenen aus derselben4. Brockenplatte, um sicherzustellen, dass fast genetisch isogene Individuen zu einer bestimmten Probe hinzugefügt werden. Setzen Sie den Deckel wieder auf den LSCP. Wiederholen Sie die Schritte für alle LSCPs. 7. Wurmwachstum im Raum mit kontrollierter Temperatur (CT) Nach dem Spotbleichen den Deckel fest auf das LSCP legen und in den auf 20 °C eingestellten CT-Raum mit konstantem Luftstrom und einer 12L:12D-Photoperiode (12 h Licht und 12 h Dunkelheit) legen. Notieren Sie sich die Zeit und Position, an der die Probe im CT-Raum platziert wurde.HINWEIS: Die Position innerhalb des Raumes sollte immer dokumentiert werden, um alle Umweltunterschiede aufzuzeichnen, die Proben während des Wachstums möglicherweise feststellen könnten. Sobald sich die Probe im CT-Raum befindet, sollte sie ungestört an der zugewiesenen Stelle bleiben. Öffnen Sie den Deckel des LSCP nicht im CT-Raum, um die Wahrscheinlichkeit einer Kontamination zu verringern. Bringen Sie das LSCP zu einem Mikroskop außerhalb des CT-Raums, um das Bevölkerungswachstum und die Dichte zu beobachten.HINWEIS: Jeder C. elegans Stamm und jede Probe variiert in seinem Wachstum, also überwachen Sie die Proben genau. Während es empfohlen wird, das Wachstum des LSCP im CT-Raum nicht zu stören, wurden LSCPs aus dem CT-Raum transportiert und die Deckel wurden alle 2 Tage geöffnet, um das Probenwachstum zu überwachen. Wenn die versiegelten Deckel alle 2 Tage von den LSCPs entfernt werden, kann auch O2 in das LSCP fließen. Stellen Sie vor der Ernte sicher, dass das LSCP mit einer großen Population von Würmern gefüllt ist. Verwenden Sie die folgenden Kriterien, um zu entscheiden, ob der LSCP zur Erfassung bereit ist. Stellen Sie sicher, dass das LSCP voller gravider erwachsener Würmer ist. Stellen Sie sicher, dass die Platte eine große Populationsgröße enthält (d. H. Würmer bedecken die gesamte Oberfläche des Agars). Stellen Sie sicher, dass der Teller nicht viele Eier auf der Oberfläche des Agars hat(dhdie maximale Anzahl von Würmern sollte geschlüpft sein). Stellen Sie sicher, dass die Platte nur noch minimale bis keine E. coli mehr hat, was darauf hindeutet, dass die Würmer verhungern und dauer Larven erzeugen würden, wenn sie für weitere zwei Tage auf der Platte gelassen würden.HINWEIS: Obwohl die meisten LSCPs je nach Stamm und Probe zwischen 10 und 20 Tagen erntebereit sind, sollten Sie jeden LSCP bei der Erstellung dieses Protokolls regelmäßig überprüfen, um die normalen Erntezeiten zu bestimmen. Reinigen Sie die Handschuhe und den Bereich mit 70% Ethanol zwischen den LSCPs, um Kreuzkontaminationen zwischen den Stämmen zu vermeiden. 8. Ernte der LSCP-Probe Schalten Sie die Zentrifuge ein und lassen Sie sie vor der Probenernte auf 4 °C abkühlen. Bereiten Sie drei konische 50-ml-Röhrchen mit 50 ml M9-Lösung pro LSCP vor, die geerntet werden sollen. Beschriften Sie ein 15 mL konisches Röhrchen pro LSCP.HINWEIS: Alle Zentrifugationsschritte werden im konischen 15-ml-Rohr durchgeführt, da Würmer dazu neigen, in diesen Rohren gut zu pelletieren. Gießen Sie 50 ml M9-Lösung (aus einem 50-ml-Konikrohr in Schritt 8.2) auf die LSCP-Oberfläche und wirbeln Sie herum, um sicherzustellen, dass M9 die gesamte NGMA-Oberfläche abdeckt. Während M9 auf der LSCP-Oberfläche sitzt, grundieren Sie eine sterile serologische Pipette mit M9.HINWEIS: Durch die Grundierung der sterilen serologischen Pipette mit M9 wird sichergestellt, dass weniger Würmer an der Innenseite der Kunststoffpipette haften bleiben, wodurch Probenverlust verhindert wird. Kippen Sie den LSCP so, dass sich M9 und die Wurmpopulation in einer Ecke des LSCP versammeln.HINWEIS: Die Mischung aus M9-Lösung und Würmern aus dem LSCP wird in nachgeschalteten Schritten als “Schneckensuspension” bezeichnet. Mit einer grundierten serologischen Pipette mit automatischem Pipttor, Pipettenschneckenaufhängung und in das ursprüngliche 50 mL konische Rohr legen. Sobald 50 ml Wurmsuspension gesammelt sind, legen Sie das konische Rohr auf eine Wippe, um Bakterienklumpen und Trümmer zu stören. Wiederholen Sie die Schritte 8,4 – 8,7 und sammeln Sie 150 ml Schneckensuspension pro LSCP. 15 mL Schneckensuspension aus einem der drei konischen 50-ml-Röhrchen werden durch Gießen in ein markiertes 15-ml-Konusrohr, das in Schritt 8.3 beiseite gelegt wurde, übertragen. Zentrifuge das 15 mL konische Rohr bei 884 x g für 1 min bei 4 °C. Die Mehrheit der Würmer wird am Boden des Rohres pelletieren. Saugen Sie den Überstand ab, um das Wurmpellet nicht zu stören. Fügen Sie weiterhin etwa 13 ml Schneckensuspension in dasselbe konische 15-ml-Rohr hinzu und wiederholen Sie die Schritte 8,9 und 8,10, bis alle 150 ml Wurmsuspension verbraucht sind. Kehren Sie das Rohr um und stören Sie das Pellet zwischen den Zentrifugationen, um so viele Bakterien und Ablagerungen wie möglich zu waschen und abzusaugen.HINWEIS: In diesem Schritt wird der Inhalt aller drei konischen 50-ml-Rohre in einem einzigen 15-ml-Rohr kondensiert. 10 ml sauberes M9 in das 15 ml konische Rohr geben und das Wurmpellet durch Invertieren rühren. Zentrifuge das 15 mL konische Rohr bei 884 x g für 1 min bei 4 °C. Saugen Sie den Überstand ab, um das Wurmpellet nicht zu stören. Wiederholen Sie diesen Vorgang zweimal.HINWEIS: Wenn sich in der Probe eine große Menge an Ablagerungen oder Bakterien befindet, wiederholen Sie Schritt 8.12, bis die Probe sauber ist. Sobald die Probe sauber ist, geben Sie ddH2O zum Wurmpellet für insgesamt 10 ml ddH2O und Würmer. Rühren Sie das Wurmpellet durch Invertieren. Gehen Sie schnell in Schritt 9.1 über, da Würmer 5 Minuten oder weniger in ddH2O bleiben müssen, um osmotischen Stress zu vermeiden.HINWEIS: Das Suspendieren von Wurmpellets inddH2O ist das bevorzugte Lösungsmittel für nachgeschaltete Omics-Schritte. Würmer können in anderen Lösungsmitteln oder Puffern suspendiert werden, wenn sie mit einem bestimmten experimentellen Workflow kompatibel sind. 9. Bevölkerungsgröße schätzen HINWEIS: Gehen Sie schnell durch die Schritte 9.1 bis 9.7. Die Mischung ausddH2Ound Würmern aus Schritt 8.13 wird in nachfolgenden Schritten als “Wurmprobe” bezeichnet. Vor dem Pipettieren der Wurmprobe ist die Prime-Pipettenspitze mit M9 zu verwenden, um zu vermeiden, dass Würmer an der Innenseite der Kunststoffpipette haften bleiben, um Probenverlust zu verhindern und die Anzahlschwankungen zu reduzieren. Nehmen Sie eine 100 μL aliquote Wurmprobe und verdünnen Sie sie in 900 μL M9. Gut mischen und eine serielle Verdünnung vornehmen (1:10, 1:100, 1:1000). Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal, um insgesamt drei Sätze aliquoter Replikate zu erreichen.HINWEIS: Pipettierwürmer können zu einer hohen Variabilität der Probenpopulationen führen. Stellen Sie sicher, dass die Wurmprobe homogen ist, bevor Sie das gewünschte Aliquot pipettieren. Stellen Sie das konische 15-ml-Rohr auf eine Wippe, um die bewegte Kultur fortzusetzen, während Aliquoten gezählt werden. Stellen Sie sicher, dass die Wurmprobe gut gemischt und homogen ist. Pipetten Sie 5 μL aus der 1:10-Wurmprobe, dosieren Sie sie auf einen Objektträger und zählen Sie die Anzahl der Würmer. Wenn diese Zahl kleiner als etwa 50 Würmer ist, dann zählen Sie auch die Verdünnungen 1:100 und 1:1000. Wenn es mehr als 50 ist, fahren Sie mit der nächsten seriellen Verdünnung um.HINWEIS: Wenn zu viele Würmer nicht genau gezählt werden können, verwenden Sie stattdessen die nächste serielle Verdünnung zum Zählen. Zählen Sie jedes aliquote Replikat jeder Verdünnung 3x. Am Ende der Zählung werden für die meisten Kulturen 9 Gesamtzählungen dokumentiert(d.h.3 Gesamtzählungen für jede aliquote Replikation). Mittelung der Verdünnungszahlen, um die geschätzte Populationsgröße der Wurmprobe zu bestimmen. Diese Verdünnungszahlen bestimmen das Volumen der Wurmprobe, das benötigt wird, um die gewünschte aliquote Größe für -omics-Schritte zu erzeugen.HINWEIS: In diesem Experiment wurden Aliquoten von etwa 200.000 Mischphasenwürmern erzeugt. Zusätzlich wurde ein Aliquot von ca. 50.000 Mischtischwürmern für die Sortierung in einem großen Partikel-Durchflusszytometer reserviert (beschrieben in Schritt 10). Sobald die Wurmprobe in geeignete Aliquoten aufgeteilt wurde, gefrieren Sie in flüssigem Stickstoff und lagern Sie die Probe bei -80 °C.HINWEIS: Frieren Sie das Aliquot, das für die Durchflusszytometrie großer Partikel bestimmt ist, nicht ein. 10. (Optional) Vorbereitungsprobe für die Großpartikel-Durchflusszytometrie HINWEIS: Die Schritte 10, 11 und 12 sind die bevorzugte Methode der Autoren, um das Stichprobenwachstum(d. H.Populationsgröße und Populationsverteilung der Lebenszyklusphasen von C. elegans) aufzuzeichnen und den Erfolg einer Kultur zu bestimmen. Benutzer dieses Protokolls können die optionalen Schritte 10, 11 und 12 durch ihre eigenen Metriken für den Wachstumserfolg ersetzen. Die Schritte 10, 11 und 12 werden hier aus zwei Gründen beschrieben. Erstens können Benutzer, die geräteweise in den Schritten 10, 11 und 12 verwendet haben, diese Schritte replizieren und zweitens, um die Validierung dieser Wachstumsmethode zu zeigen. Schritt 9 oben bietet eine gute Schätzung der Gesamtzahl der Würmer, um aliquote Größen zu bestimmen, und Schritt 10 ist eine quantitativere Metrik, um die Anzahl und Populationsverteilung von Würmern in einer bestimmten Stichprobe zu schätzen. Bringen Sie das Aliquot von etwa 50.000 Mischphasenwürmern (in Schritt 9.6 beiseite gelegt) auf ein Gesamtvolumen von 10 ml in M9-Lösung. Es wird eine Lösung aus 1 mg/ml E. coli und einer 1:50-Verdünnung von 0,5 μM rot fluoreszierenden Mikrosphären19 herstellen. 200 μL dieser Lösung zu den 10 ml Mischphasenwürmern in M9 geben und während des Schaukelns 20 min inkubieren. Nach 20 min zentrifugiert man das 15 mL konische Röhrchen bei 884 x g für 1 min bei 4 °C. Saugen Sie den Überstand ab, um das Wurmpellet nicht zu stören. Waschen Sie das Wurmpellet zweimal mit M9-Lösung, um überschüssige Bakterien und rot fluoreszierende Mikrosphären zu beseitigen. Fügen Sie 5 ml M9 zum Wurmpellet hinzu und stellen Sie sicher, dass das Pellet sauber aussieht. Wenn das Pellet sauber ist, fügen Sie 5 ml M9 mit 50 mM Natriumazid hinzu, um die Würmer sowohl zu richten als auch abzutöten, um genau zu zählen und21zu dimensionieren. Dokumentieren Sie Uhrzeit und Datum, an dem Natriumazid zur Probe hinzugefügt wird. Legen Sie die Probe auf der Wippe beiseite, bis sie für die Großpartikel-Durchflusszytometrie benötigt wird.HINWEIS: Es ist bekannt, dass Natriumazid die Physiologie der Nematoden beeinflusst(dhKörperlänge, Stoffwechsel und Thermotoleranz). Daher ist es wichtig zu beachten, wie lange Würmer Natriumazid ausgesetzt sind, da viele dieser physiologischen Auswirkungen innerhalb weniger Minutenauftreten 22. Aufgrund der bekannten physiologischen Wirkungen von Natriumazid auf Würmer wirkt sich diese Behandlung auf die nachgeschaltete Bildqualität aus und sollte in Betracht gezogen werden. 11. (Optional) Dokumentation der Populationsverteilung und Vorbereitung der 384-Well-Platte für die Bildgebung HINWEIS: Schritt 11 verwendet ein großes Partikel-Durchflusszytometer (LPFC). Grundkenntnisse eines LPFC werden in diesem Protokoll vorausgesetzt. Andere Methoden können ersetzt werden, um das Wachstum und die Populationsverteilung von Stichproben zu dokumentieren. Die hier dokumentierten Schritte richten sich an Benutzer, die einen LPFC in ihrer Pipeline verwenden möchten23. Schalten Sie den LPFC ein, reinigen und grundieren Sie ihn und lassen Sie den Laser 1 h lang erwärmen, bevor Sie die Proben sortieren. Nachdem sich der Laser erwärmt hat, öffnen Sie das “Histogramm” -Profil und skalieren Sie auf eine Flugzeit (TOF) von 2050. Fügen Sie dem “Histogramm” einen Balkenbereich hinzu, der einen TOF-Bereich von 100 umfasst. Der erste Barbereich deckt einen TOF von 50-150 ab. Erstellen Sie weiterhin zwanzig Balkenbereiche, die jeweils einen TOF-Bereich von 100 umfassen. Diese Balkenbereiche werden den gesamten TOF-Bereich von 50 bis 2050 umfassen. In der ergänzenden Tabelle 1 finden Sie die genauen gated-Bereiche, die in der TOF-Verteilung verwendet werden sollen. Speichern Sie dieses Histogramm als “Experiment” für zukünftige LPFC-Läufe. Wählen Sie eine kalibrierte 384-Well-Platte oder kalibrieren Sie das Gerät auf eine 384-Well-Platte, in die Objekte dosiert werden sollen. Legen Sie die Vorlage nach der kalibrierten 384-Well-Plattenvorlage so fest, dass 20 gated Objekte in vier Wells (vier technische Replikate jeder Gated-Region) für jeden der 20 Balkenbereiche ausgegeben werden, die in den Schritten 11.3-4 erstellt wurden. In der ergänzenden Tabelle 2 finden Sie ein Beispiellayout für die Dosierung von Würmern in die 384-Well-Platte. Die Probe aus Schritt 10.9 wird in ein konisches Röhrchen mit 50 ml gegeben und zusätzliche M9-Lösung hinzugefügt, um ein Gesamtvolumen von etwa 40 ml zu erreichen. Beginnen Sie mit der automatischen Sortierung der Probe nach den in Schritt 11.7 festgelegten Parametern, während Sie die Probe kontinuierlich rühren, um zu verhindern, dass sich Objekte aus der Probe absetzen und gleichzeitig in die kalibrierte 384-Well-Platte dosieren.HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Durchflussrate des LPFC zwischen 15 und 20 Objekten pro Sekunde arbeitet, und geben Sie keine Doppelungen an, die sortiert werden sollen. Sobald die gesamte Probe sortiert und die maximale Anzahl der gated-Bereiche in die 384-Well-Platte abgegeben wurde, nehmen Sie die Probe von LPFC und reinigen Sie das Instrument.HINWEIS: Wenn größere TOF-Regionen erreicht werden, kann es aufgrund der geringen Ereigniszahlen in diesem TOF-Bereich schwierig werden, die 384-Well-Platte weiterhin zu füllen. Füllen Sie so viele der gated-Regionen wie möglich aus, um die beste Vorstellung davon zu bekommen, wo die Lebensphasen von C. elegans in die LPFC-Verteilung fallen, bevor die Probe ausgeht. Legen Sie eine Siegelfolie auf die 384-Well-Platte, bis sie abgebildet ist.HINWEIS: Bildplatte so schnell wie möglich nach der Sortierung, da Proben mit Natriumazid22behandelt werden. Rot fluoreszierende Mikrosphären können in den gesammelten LPFC-Datendateien(d. H. PH-Rot-Daten in der Ausgabetextdatei) basierend auf dem Grad der roten Fluoreszenz gesehen werden, die in jedem sortierten Objekt emittiert wird, um zu identifizieren, welche Objekte lebende Würmer, tote Würmer, Dauers oder Junksind 24. 12. (Optional) Imaging 384-Well-Platte HINWEIS: Schritt 12 verwendet ein mikrokonfokaleses Mikromikroskop zum Lesen der Platte. Grundkenntnisse eines konfokalen Mikromikroskops werden in diesem Protokoll vorausgesetzt. Andere Methoden können ersetzt werden, um das Wachstum und die Populationsverteilung von Stichproben zu dokumentieren. Verwendung eines plattenlesenden mikrokonfokalen Mikroskops mit einer 20-fachen Linse. Öffnen Sie die Registerkarte” Ziel und Kamera” und stellen Sie den Modus “10x Plan ApoLambda” ein. Öffnen Sie die Registerkarte “Camera Binning” und stellen Sie auf “2” ein. Öffnen Sie die Registerkarte “Sites to Visit on Plate” und setzen Sie auf “4” Sites pro Well und “Overlap Sites 10%”, um später Bilder zusammenzusetzen. Öffnen Sie die Registerkarte “Wellenlänge” und stellen Sie sie auf “Hellfeld 1” ein. Öffnen Sie die Registerkarte “Beleuchtung” und stellen Sie sie auf “Durchlicht, helle Probe” ein. Legen Sie die 384-Well-Platte in das Mikroskop und stellen Sie den “Z Stack” auf “Calculate Offset” und finden Sie die richtige Fokusebene für die Proben in der 384-Well-Platte. Führen Sie die 384-Well-Platte auf dem konfokalen Mikromikroskop aus und sammeln Sie vier Bilder pro Vertiefung. Montage der vier Bilder zusammen, um ein Bild pro Vertiefung zu erstellen.