Cultuur en assay van grootschalige gemengde caenorhabditis elegans populaties

1. Steriliseer LSCP en apparatuur Bereid glazen LSCPs voor door met de hand te wassen, gevolgd door afwassen en daaropvolgende autoclaaf om ervoor te zorgen dat glaswerk vrij is van verontreinigingen voordat u met het experiment begint. Bewaar autoclaaf LSCPs op een schone droge plaats tot in gebruik.OPMERKING: Zorg ervoor dat LSCPs vaatwasmachine- en autoclaafbestendig zijn. Zorg ervoor dat de LSCP-deksels vaatwasmachinebestendig zijn. Bereid LSCP-deksels door met de hand te wassen, gevolgd door afwassen. Bewaar LSCP-deksels in een schone bak totdat dit nodig is. Op de dag dat Nematode Growth Media Agarose (NGMA) is voorbereid, veegt u LSCP-deksels twee keer af met 10% bleekoplossing, gevolgd door 70% ethanol. Eenmaal afgeveegd met 10% bleekmiddel en 70% ethanol, bewaar LSCP-deksels in een schone bak in de laminaire stroomkap waar de NGMA wordt voorbereid. 2. Bereid nematodengroeimedia agarose voor (NGMA) Bereid NGMA door de volgende reagentia te combineren in een autoclaafkolf van 2 L Erlenmeyer met roerstaaf op een roerplaat: 2,5 g pepton, 3 g NaCl, 7 g agarose, 10 g agar en 975 ml steriel water16. Zorg ervoor dat het totale volume gelijk is aan 1 L. Plak een foliedop op de kolf.OPMERKING: De voorbereidingsstappen voor de NGMA zoals hier beschreven, leveren voldoende materiaal op voor 2,5 LSCPs. Het protocol kan worden aangepast aan de benodigde LSCP-batchgrootte in een bepaald experiment. Autoclaaf op vloeistofcyclus bij 121 °C en 21 p.s.i. gedurende 45 min. Zet het waterbad aan en zet op 50 °C. Breng de autoclaaf NGMA naar het waterbad om af te koelen tot 50 °C. Breng 2 L Erlenmeyer kolf van NGMA in de kap of gereinigde ruimte en zet op een roerplaat. Gebruik een thermometer om de NGMA-temperatuur bij te houden. Nadat de NGMA 50 °C heeft bereikt, voegt u het volgende toe in de volgorde vermeld met een steriele wegwerppipet in de kap of gereinigde ruimte:25ml van 1 ml KH 2 PO4 (K-fosfaatbuffer), 1 ml cholesterol (5 mg/ ml in ethanol), 1 ml van 1 M CaCl 2, 1 ml van 1 M MgSO 4 , 1 ml nystatine(1mg / ml in ethanol), 1 ml 1 ml 1 mL cacl2,1 ml van 1 m MgSO4,1 ml nystatine (1 mg/ ml in ethanol) Giet 400 ml NGMA in een steriel glazen LSCP, ongeveer 1,3 cm diep, laat de LSCP stollen op een plat oppervlak in de kap en plaats het deksel van de autoclaaffolie terug op de LSCP. Zodra de agar is ingesteld, verwijdert u de folie en plaatst u een schoon luchtdicht deksel op LSCP en gaat u naar 4 °C voor opslag. Bewaar NGMA in LSCPs bij 4 °C tot in gebruik en gebruik binnen 5 dagen. 3. Genereer E. coli-voedsel voor NGMA op LSCP Om een stabiele voedselbron te genereren, genereert u batches HT115 (DE3) E. coli met behulp van een klein batchmiddelingsconcept dat overeenkomt met de centrale limietstelling17. Bewaren bij -80 °C. Trek indien nodig E. coli bacteriebestand(en) van -80 °C tot dooi18.OPMERKING: In dit protocol werden E. coli bacteriebestanden gekweekt in een bioreactor. Aan het einde van de cultuurgroei werd de cultuur verwaterd 1:50 en de gemeten OD600 was 0,4. Aldus, had de cultuur een efficiënte OD600 van 20. Bacteriën werden geplet, gewogen en geresuspendeerd in K-medium bij een concentratie van 0,5 g/ml (nat gewicht), overgebracht in 2 ml aliquots en bevroren19. 4. Bacterieel gazon op NGMA Breng NGMA LSCPs van 4 °C enkele uren op kamertemperatuur (RT) voordat u het bacteriële gazon verspreidt, zodat de hele LSCP RT kan bereiken. Haal de benodigde E. coli bacterievoorraden uit van -80 °C tot dooi18. Verdun E. coli bacteriebestand(en) met 2 ml steriel K-medium om 0,5 g E. coli te bereiken in 4 ml per NGMA LSCP. Pipetteer voorzichtig 4 ml E. coli in het midden van de NGMA LSCP. Gebruik een steriele strooier om bacteriën in een rechthoek te verspreiden, waardoor ongeveer 3,8 cm ruimte rond de randen van de NGMA E. coli vrij blijft. Laat de NGMA LSCP met E. coli in de motorkap met de ventilator op gedurende 1 uur om ervoor te zorgen dat de E. coli suspensie volledig droogt. Zodra het bacteriële gazon droog is, duwt u het deksel stevig aan en bewaart u het bij 4 °C tot het wordt gebruikt. 5. Chunk wormen om stress en leeftijdsvariabiliteit tussen monsters te verminderen Streepwormen van een bevroren wormenbouillon naar een nieuw gezaaid bord van 6 cm4. Deze plaat zal dienen als de “master chunk” plaat.OPMERKING: Chunking is een optimale methode om wormen over te brengen van een homozygote stam20. Als een soort heterozygoot is of moet worden onderhouden door te plukken en te paren, is brokken niet aan te raden. Chunking frequentie kan nodig zijn om te worden geoptimaliseerd, afhankelijk van worm genotypen gebruikt, temperatuur gekozen voor groei, en downstream stappen. Nadat de master chunk plate vol zit met gezonde gravid volwassenen (ongeveer 3 dagen) met veel E. coli gazon nog steeds aanwezig, volg de standaard C. elegans chunking richtlijnen zoals beschreven in WormBook om vier totale chunk plates te produceren4. Bewaar alle brokplaten in een ct-ruimte (controlled temperature) bij 20 °C, tenzij anders aangegeven voor groei.OPMERKING: Als gebruikers van dit protocol geen toegang hebben tot een CT-ruimte zoals hier beschreven, wordt aanbevolen om een kleine incubator te gebruiken waar de temperatuur kan worden geregeld of een aangewezen ruimte waar de omgevingsomstandigheden zoveel mogelijk kunnen worden geregeld. Als geen van deze alternatieve opties beschikbaar is, moet u er rekening mee houden dat de variatie in de groei van de steekproef groter kan zijn. Zodra veel gravid volwassenen worden waargenomen in de 4e brokplaat, ga je verder met stap 6. 6. Spot blekende gravid volwassenen op LSCP OPMERKING: Deze bleektechniek wordt gebruikt om de meeste verontreinigingen uit te roeien en de nagelriem van de hermafrodieten op te lossen die embryo’s van de volwassen worm vrijgeven. De bleekoplossing zal in de NGMA weken voordat de embryo’s uitkomen. Breng LSCPs enkele uren naar RT voordat u bleekwormen ziet. Bereid een verhouding van 7:2:1 ddH2O : bleekmiddel : 5 M NaOH. Maak deze alkalische hypochlorietoplossing vlak voor gebruik vers.OPMERKING: Gebruik dezelfde voorraad bleekmiddel en NaOH gedurende de duur van een bepaald experiment om te voorkomen dat bleekmiddel partij beïnvloedt. Bleekmiddel gebruikt in dit protocol was 5-10% natriumhypochloriet. Steek een Bunsen brander aan en vlam een wormpriem voordat je verder gaat. Schep verse E. coli op een steriele plectrum vanaf de rand van het bacteriegazon op de LSCP. Kies een enkele gravid volwassene van de 4e brokplaat voor spot bleken. Pipet 5 μL van de alkalische hypochlorietoplossing in een hoek van de LSCP, weg van het E. coli gazon. Plaats de geplukte gravid volwassene in de 5 μL alkalische hypochlorietoplossing. Tik op de nematode om de nagelriem te verstoren en eieren vrij te geven. Herhaal stap 6.4 – 6.6 voor een totaal van 4x en plaats 5 gravid volwassenen gelijkmatig rond het E. coli gazon. Kies alle 5 gravid volwassenen uit dezelfde 4e brokplaat om ervoor te zorgen dat bijna genetisch isogene individuen aan een bepaald monster worden toegevoegd. Plaats het deksel terug op de LSCP. Herhaal stappen voor alle LSCPs. 7. Wormgroei in gecontroleerde temperatuur (CT) ruimte Plaats na het bleken het deksel stevig op de LSCP en plaats het in de CT-ruimte ingesteld op 20 °C met constante luchtstroom en een 12L:12D fotoperiode (12 uur licht en 12 uur duisternis). Noteer de tijd en positie waar het monster in de CT-ruimte is geplaatst.OPMERKING: De positie in de ruimte moet altijd worden gedocumenteerd om eventuele omgevingsverschillen vast te leggen die monsters kunnen tegenkomen tijdens het groeien. Zodra het monster zich in de CT-kamer bevindt, moet het ongestoord op de toegewezen plek blijven. Open het deksel van de LSCP niet in de CT-ruimte om de kans op besmetting te verkleinen. Breng de LSCP naar een microscoop, buiten de CT-kamer, om de bevolkingsgroei en dichtheid te observeren.OPMERKING: Elke C. elegans stam en monster zal variëren in zijn groei, dus controleer monsters nauwlettend. Hoewel het wordt aanbevolen om de groei van de LSCP niet te verstoren terwijl in de CT-kamer, LSCPs werden vervoerd uit de CT-kamer en deksels werden geopend om de 2 dagen om de monstergroei te controleren. Door de verzegelde deksels om de 2 dagen van de LSCPs te halen, kan O2 ook in de LSCP stromen. Zorg er voor de oogst voor dat de LSCP vol zit met een grote populatie wormen. Gebruik de volgende criteria om te bepalen of de LSCP klaar is om te worden verzameld. Zorg ervoor dat de LSCP vol zit met gravid volwassen wormen. Zorg ervoor dat de plaat een grote populatiegrootte bevat (d.w.z. wormen bedekken het hele oppervlak van de agar). Zorg ervoor dat de plaat niet veel eieren op het oppervlak van de agar heeft(d.w.z.het maximale aantal wormen moet zijn uitgekomen). Zorg ervoor dat de plaat minimaal tot geen E. coli meer heeft, wat aangeeft dat de wormen zouden verhongeren en dauerlarven zouden genereren als ze nog twee dagen op de plaat zouden blijven liggen.OPMERKING: Hoewel de meeste LSCPs klaar zijn om te oogsten tussen 10 en 20 dagen, afhankelijk van stam en monster, controleer elke LSCP regelmatig bij het vaststellen van dit protocol om de normale oogsttijden te bepalen. Reinig handschoenen en een gebied met 70% ethanol tussen het hanteren van LSCPs om kruisbesmetting tussen stammen te voorkomen. 8. Het LSCP-monster oogsten Schakel in en laat de centrifuge afkoelen tot 4 °C voordat u monsters oogst. Bereid drie 50 ml conische buizen voor met 50 ml M9-oplossing per LSCP die moet worden geoogst. Label één conische buis van 15 ml per LSCP.OPMERKING: Alle centrifugeerstappen worden uitgevoerd in de conische buis van 15 ml, omdat wormen de neiging hebben om goed in deze buizen te pelleten. Giet 50 ml M9-oplossing (van één 50 ml conische buis in stap 8.2) op het LSCP-oppervlak en wervel rond om ervoor te zorgen dat M9 het hele NGMA-oppervlak bedekt. Terwijl M9 op het LSCP-oppervlak zit, prime een steriele serologische pipet met M9.OPMERKING: Door de steriele serologische pipet met M9 aan te primen, zorgt dit ervoor dat er minder wormen aan de binnenkant van de plastic pipet blijven plakken, waardoor monsterverlies wordt voorkomen. Kantel de LSCP zodat M9 en de wormpopulatie zich verzamelen in een hoek van de LSCP.OPMERKING: Het mengsel van M9-oplossing en wormen uit de LSCP wordt in stroomafwaartse stappen de “wormsuspensie” genoemd. Met behulp van een geprimeerde serologische pipet met een automatische pipettor, pipet worm ophanging en plaats in de originele 50 ml conische buis. Zodra 50 ml wormsuspensie is verzameld, plaatst u de conische buis op een rocker om bacterieklonters en vuil te verstoren. Herhaal stap 8.4 – 8.7 waarbij 150 ml wormsuspensie per LSCP wordt verzameld. Breng 15 ml wormsuspensie over uit een van de drie conische buizen van 50 ml door in een gelabelde conische buis van 15 ml te gieten die in stap 8.3 opzij is gezet. Centrifugeer de conische buis van 15 ml gedurende 1 min bij 4 °C op 884 x g. De meerderheid van de wormen zal pellet op de bodem van de buis. Aspireer van het supernatant om de wormkorrel niet te verstoren. Blijf ongeveer 13 ml wormsuspensie toevoegen aan dezelfde conische buis van 15 ml die stap 8.9 en 8.10 herhaalt totdat alle 150 ml wormsuspensie is verbruikt. Keer de buis om en verstoor de pellet tussen de centrifuges om zoveel mogelijk bacteriën en vuil te wassen en af te zuigen.OPMERKING: Bij deze stap wordt de inhoud van alle drie de 50 ml conische buizen gecondenseerd in een enkele buis van 15 ml. Voeg 10 ml schone M9 toe aan de conische buis van 15 ml en roer de wormkorrel door om te keren. Centrifugeer de conische buis van 15 ml gedurende 1 min bij 4 °C op 884 x g. Aspireer van het supernatant om de wormkorrel niet te verstoren. Herhaal dit twee keer.OPMERKING: Als er een grote hoeveelheid vuil of bacteriën in het monster zit, herhaalt u stap 8.12 totdat het monster schoon is. Zodra het monster schoon is, voegt u ddH2O toe aan de wormkorrel voor een totaal van 10 ml ddH2O en wormen. Roer de wormkorrel door om te keren. Ga snel naar stap 9.1, omdat wormen 5 minuten of minder in ddH2O moeten blijven om osmotische stress te voorkomen.OPMERKING: Het opschorten van wormkorrels in ddH2O is het voorkeursoplosmiddel voor downstream -omics-stappen. Wormen kunnen worden opgehangen in andere oplosmiddelen of buffers als ze compatibel zijn met een bepaalde experimentele workflow. 9. Schatting bevolkingsomvang OPMERKING: Ga snel door stap 9.1 – 9.7. Het mengsel van ddH2O en wormen uit stap 8.13 wordt in de volgende stappen het “wormmonster” genoemd. Voorafgaand aan het pipetten van het wormmonster, prime pipet tip te gebruiken met M9 om te voorkomen dat wormen plakken aan de binnenkant van de plastic pipet het voorkomen van monsterverlies en het verminderen van de telvariatie. Neem een 100 μL aliquot wormmonster en verdun het tot 900 μL M9. Meng goed en maak een seriële verdunning (1:10, 1:100, 1:1000). Herhaal deze stap twee keer om in totaal drie sets aliquot-replica’s te bereiken.OPMERKING: Pipettende wormen kunnen een hoge variabiliteit in het aantal monsterpopulaties veroorzaken. Zorg ervoor dat het wormmonster homogeen is voordat u het gewenste aliquot pipett. Zet de 15 ml conische buis op een rocker om de bewegende cultuur voort te zetten terwijl aliquots worden geteld. Zorg ervoor dat het wormmonster goed gemengd en homogeen is. Pipet 5 μL uit het 1:10 wormmonster, verdeel het over een microscopieschuif en tel het aantal wormen. Als dit aantal minder dan ongeveer 50 wormen is, tel dan ook de verdunningen van 1:100 en 1:1000. Als het meer dan 50 is, gaat u naar de volgende seriële verdunning.OPMERKING: Als te veel wormen niet nauwkeurig kunnen worden geteld, gebruikt u in plaats daarvan de volgende seriële verdunning om te tellen. Tel elke aliquot repliceren van elke verdunning 3x. Aan het einde van de telling worden voor de meeste culturen 9 totale tellingen gedocumenteerd(d.w.z.3 totale tellingen voor elke aliquot-replica). Gemiddeld het verdunningsaantal om de geschatte populatiegrootte van het wormmonster te bepalen. Deze verdunningstellingen bepalen het volume wormmonster dat nodig is om de gewenste aliquotgrootte voor -omics-stappen te maken.OPMERKING: In dit experiment werden aliquots van ongeveer 200.000 wormen in gemengd stadium gegenereerd. Bovendien werd één aliquot van ongeveer 50.000 wormen in gemengd stadium gereserveerd voor sortering in een grote deeltjesstroomcytometer (beschreven in stap 10). Zodra het wormmonster in geschikte aliquots is gesplitst, vriest u in vloeibare stikstof en slaat u het monster op bij -80 °C.OPMERKING: Vries de aliquot die bestemd is voor cytometrie met grote deeltjesstromen niet in. 10. (Optioneel) Voorbereidingsmonster voor cytometrie met grote deeltjesstroom OPMERKING: Stappen 10, 11 en 12 zijn de voorkeursmethode van de auteurs om de steekproefgroei(d.w.z.de populatiegrootte en populatieverdeling van de levenscyclusfasen van C. elegans) vast te leggen en het succes van een cultuur te bepalen. Gebruikers van dit protocol kunnen optionele stappen 10, 11 en 12 vervangen door hun eigen statistieken voor groeisucces. De stappen 10, 11 en 12 worden hier om twee redenen beschreven; ten eerste kunnen gebruikers met apparatuur die wordt gebruikt in stap 10, 11 en 12 deze stappen repliceren en ten tweede, om validatie van deze groeimethode weer te geven. Stap 9 hierboven geeft een goede schatting van het totale aantal wormen om aliquotgroottes te bepalen, en stap 10 is een meer kwantitatieve statistiek om het aantal en de populatieverdeling van wormen in een bepaald monster te schatten. Breng de aliquot van ongeveer 50.000 wormen in gemengd stadium (opzij gezet in stap 9.6) tot 10 ml totaal volume in M9-oplossing. Maak een oplossing bestaande uit 1 mg/ml E. coli en een verdunning van 1:50 van 0,5 μM rode fluorescerende microbolletjes19. Voeg 200 μL van deze oplossing toe aan de 10 ml wormen met gemengd stadium in M9 en incubeer tijdens het schommelen gedurende 20 minuten. Centrifugeer na 20 min de conische buis van 15 ml op 884 x g gedurende 1 min bij 4 °C. Aspireer van het supernatant om de wormkorrel niet te verstoren. Was de wormkorrel twee keer met M9-oplossing om overtollige bacteriën en rode fluorescerende microbolletjes te elimineren. Voeg 5 ml M9 toe aan de wormkorrel en zorg ervoor dat de pellet er schoon uitziet. Als de pellet schoon is, voeg dan 5 ml M9 met 50 mM natrium azide toe om zowel de wormen recht te maken als te doden voor nauwkeurig tellen en dimensioneren21. Documenteer de tijd en datum waarop natriumaziide aan het monster wordt toegevoegd. Zet het monster opzij op de rocker tot het nodig is voor cytometrie met grote deeltjesstromen.OPMERKING: Van natrium azide is bekend dat het de fysiologie van nematoden beïnvloedt(d.w.z.lichaamslengte, metabolisme en thermotolerantie). Daarom is het van cruciaal belang om op te merken dat wormen worden blootgesteld aan natrium azide, omdat veel van deze fysiologische effecten binnen enkele minuten plaatsvinden22. Vanwege de bekende fysiologische effecten van natrium azide op wormen, zal deze behandeling de downstream beeldkwaliteit beïnvloeden en moet worden overwogen. 11. (Optioneel) Documenteren van populatieverdeling en voorbereiden van 384-put plaat voor beeldvorming OPMERKING: Stap 11 maakt gebruik van een grote deeltjesstroomcytometer (LPFC). Basiskennis van een LPFC wordt in dit protocol verondersteld. Andere methoden kunnen worden vervangen om de groei en populatieverdeling van monsters te documenteren. De hier beschreven stappen zijn voor gebruikers die van plan zijn een LPFC in hun pijplijn te gebruiken23. Schakel de LPFC in, reinig en primeer deze en laat de laser(s) 1 uur opwarmen voordat u monsters sorteert. Nadat de laser is opgewarmd, opent u het “Histogram” profiel en schaalt u naar een Time of Flight (TOF) van 2050. Voeg een staafgebied toe aan het “Histogram” met een TOF-bereik van 100. De eerste barregio beslaat een TOF van 50-150. Ga door met het maken van twintig staafregio’s met elk een TOF-bereik van 100. Deze staafregio’s zullen het hele TOF-bereik van 50 – 2050 omvatten. Zie aanvullende tabel 1 voor de exacte gated regions die in de tof-distributie moeten worden gebruikt. Sla dit Histogram op dat is ingesteld als een “Experiment” om te gebruiken in toekomstige LPFC-uitvoeringen. Selecteer gekalibreerde 384-put plaat of kalibreer instrument naar een 384-well plaat om objecten in af te geven. Eenmaal in de gekalibreerde 384-putplaatsjabloon stelt u sjabloon in om 20 gated objecten in vier putten (vier technische replica’s van elke gated region) te doseren voor elk van de 20 bar-regio’s die tijdens stap 11.3-4 zijn gemaakt. Zie aanvullende tabel 2 voor een voorbeeld van de indeling van het doseren van wormen in de 384-putplaat. Breng het monster van stap 10.9 over in een conische buis van 50 ml en voeg extra M9-oplossing toe om een totaal volume van ongeveer 40 ml te bereiken. Begin automatisch met het sorteren van het monster volgens de parameters die zijn ingesteld in stap 11.7, terwijl u het monster continu roert om bezinking te voorkomen en tegelijkertijd voorwerpen uit het monster in de gekalibreerde 384-putplaat te doseren.OPMERKING: Zorg ervoor dat het debiet van de LPFC tussen 15-20 objecten per seconde werkt en geef geen verdubbelingen op die moeten worden gesorteerd. Zodra het hele monster is gesorteerd en het maximale aantal gated regions in de 384-putplaat is afgegeven, neemt u het monster van LPFC en reinigt u het instrument.OPMERKING: Wanneer grotere TOF-regio’s worden bereikt, kan het een uitdaging worden om de 384-putplaat te blijven vullen vanwege het lage aantal gebeurtenissen in die TOF-regio. Vul zoveel mogelijk van de omheinde regio’s om het beste idee te krijgen van waar de levensfasen van C. elegans binnen de LPFC-distributie vallen voordat het monster opraakt. Plaats een afdichtingsfolie op de 384-putplaat totdat deze in beeld is.OPMERKING: Beeldplaat zo snel mogelijk na het sorteren omdat monsters worden behandeld met natrium azide22. Rode fluorescerende microbolletjes zijn te zien in de verzamelde LPFC-gegevensbestanden(d.w.z. PH Red-gegevens in het uitvoertekstbestand) op basis van het niveau van rode fluorescentie dat in elk gesorteerd object wordt uitgezonden om te helpen identificeren welke objecten levende wormen, dode wormen, dauers of junk zijn24. 12. (Optioneel) Imaging 384-put plaat OPMERKING: Stap 12 maakt gebruik van een plaatlezende micro confocale microscoop. Basiskennis van een micro confocale microscoop wordt in dit protocol verondersteld. Andere methoden kunnen worden vervangen om de groei en populatieverdeling van monsters te documenteren. Met behulp van een plaatlezende micro confocale microscoop met een 20x lens. Open het tabblad “Objectief en Camera” en stel in op “10x Plan ApoLambda” modus. Open het tabblad “Camera Binning” en stel in op “2”. Open het tabblad “Sites om te bezoeken op plaat” en stel in op “4” sites per put en “overlap sites 10%” om later afbeeldingen aan elkaar te naaien. Open het tabblad “Golflengte” en stel in op “Brightfield 1”. Open het tabblad “Verlichting” en stel in op “Verzonden licht, helder monster”. Plaats de 384-put plaat in de microscoop en zet de “Z Stack” op “Calculate Offset” en zoek het juiste brandpuntsvlak voor de samples in de 384-well plaat. Voer de 384-put plaat op de micro confocale microscoop en verzamel vier beelden per put. Monteer de vier afbeeldingen samen om één beeld per put te creëren.