Obtenção de Microglia Humana de Tecido Cerebral Humano Adulto
Summary
Este protocolo é um método eficiente, econômico e robusto de isolar microglia primária de tecido cerebral vivo, adulto e humano. A microglia humana primária isolada pode servir como ferramenta para estudar processos celulares em homeostase e doenças.
Abstract
Microglia são células imunes inatas residentes do sistema nervoso central (SNC). A microglia desempenha um papel crítico durante o desenvolvimento, na manutenção da homeostase, e durante a infecção ou lesão. Vários grupos de pesquisa independentes têm destacado o papel central que a microglia desempenha em doenças autoimunes, síndromes autoinflamatórias e cânceres. A ativação da microglia em algumas doenças neurológicas pode participar diretamente de processos patogênicos. A microglia primária é uma ferramenta poderosa para entender as respostas imunes no cérebro, interações células-células e fenótipos de microglia desregulados na doença. Microglia primária imita propriedades microgliais in vivo melhor do que linhas de células microgliais imortalizadas. Microglia adulta humana apresenta propriedades distintas em comparação com microglia fetal e roedora humana. Este protocolo fornece um método eficiente para o isolamento da microglia primária do cérebro humano adulto. Estudar essas microglias pode fornecer insights críticos sobre as interações célula-células entre microglia e outras populações celulares residentes no CNS, incluindo oligodenrócitos, neurônios e astrócitos. Além disso, a microglia de diferentes cérebros humanos pode ser cultivada para caracterização de respostas imunes únicas para medicina personalizada e uma miríade de aplicações terapêuticas.
Introduction
O sistema nervoso central (SNC) é construído de uma complexa rede de neurônios e células gliais1. Entre as células gliais, a microglia funciona como as células imunes inatas do CNS2,3. A Microglia é responsável pela manutenção da homeostase no CNS4saudável . A microglia também desempenha um papel importante no neurodesenvolvimento, podando as sinapses2. A microglia é central para a fisiopatologia de várias doenças neurológicas, incluindo, mas não restritas; Doença de Alzheimer5, Doença de Parkinson6, derrame7, esclerose múltipla8,lesão cerebral traumática9,dor neuropática10,lesão medular11 e tumores cerebrais como gliomas12.
Estudos relacionados à homeostase e doenças do CNS utilizam microglia de roedores devido à escassez de protocolos de isolamento primário primário humano13. A microglia de roedores se assemelha à microglia humana primária na expressão de genes como Iba-1, PU.1, DAP12 e receptor M-CSF e tem sido eficaz na compreensão do cérebro normal e doente13. Curiosamente, a expressão de vários genes relacionados imunológicos como TLR4, MHC II, Siglec-11 e Siglec-3 varia entre microglia humana eroedora 13. A expressão de vários genes também varia na expressão temporal e em doenças neurodegenerativas em ambas as espécies14,15. Essas diferenças significativas fazem da microglia humana um modelo essencial para estudar a função da microglia na homeostase e na doença. A microglia humana primária também pode ser uma ferramenta eficaz para a triagem pré-clínica de potenciais candidatos a medicamentos16. As razões acima mencionadas sublinham a crescente necessidade de protocolos econômicos para o isolamento da microglia humana primária.
Desenvolvemos um protocolo para isolamento da microglia humana primária do tecido cerebral humano adulto coletado como resultado de uma janela cirúrgica criada para ressecções tumorais ou outras ressecções cirúrgicas. O método aqui é consideravelmente diferente dos métodos existentes. Conseguimos isolar e cultivar microglia após um tempo de trânsito de cerca de 75 minutos do local de coleta de tecidos para iniciar o protocolo de isolamento em laboratório. Usamos o supernascer de células fibroblastos L929 para promover o crescimento de microglia isolada. Este método foca especificamente na cultura e desenvolvimento apenas de microglia primária. A cultura resultante preparada é de cerca de 80% de microglia. Enquanto outros protocolos fornecem uma cultura enriquecida de microglia por centrífuga de gradiente de densidade, citometria de fluxo e contas magnéticas, o protocolo é uma maneira rápida, simples, robusta e econômica de cultivar microglia humana primária17,,18,,19,,20. A capacidade de utilizar tecido cerebral adulto vivo removido cirurgicamente em vez de tecidos cerebrais fixos de cadáveres prova uma vantagem adicional deste método em contraste com os procedimentos existentes18,,21.
Protocol
Representative Results
Discussion
Microglia garante homeostase no cérebro normal e desempenha papéis centrais na fisiopatologia de várias doenças neurológicas4. Microglia são centrais para o neurodesenvolvimento e formação de sinapses2. Estudos microgliais têm se mostrado fundamentais na compreensão do desenvolvimento e progressão de diversas doenças neurológicas4. A microglia de roedores é o modelo predominante de escolha para estudos microgliais primários, embora, a …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
O laboratório da SJ foi criado com subvenções institucionais da IITJ e é financiado por subvenções do Departamento de Biotecnologia (BT/PR12831/MED/30/1489/2015) e do Ministério de Eletrônica e Tecnologia da Informação do Governo da Índia (nº 4(16)/2019-ITEA). As seções de tecido cerebral humano foram obtidas do All India Institute of Medical Sciences (AIIMS) Jodhpur após a liberação do Comitê de Ética Institucional. Agradecemos a Mayank Rathor, membro do B.Tech Student da Design and Arts Society IIT Jodhpur, pelo apoio à videografia.
Materials
| Antibiotic-Antimycotic solution | Himedia | A002 | |
| Calcium chloride | Sigma | 223506 | |
| Centrifuge (4 °C) | Sigma | 146532 | |
| Centrifuge tubes | Abdos | P10203 | |
| CO2 incubator | New Brunswik | Galaxy 170 S | |
| D-Glucose | Himedia | GRM077 | |
| DMEM medium with glutamine | Himedia | AL007S | |
| Fetal bovine serum | Himedia | RM9955 | |
| Flacon tube (50 ml) | Thermo Fsiher Scientific | 50CD1058 | |
| Fluorescein Ricinus communis agglutinin-1 | Vector | FL-1081 | |
| Fluorescent microscope | Leica | DM2000LED | |
| Fluoroshield with DAPI | Sigma | F6057 | |
| GFAP antibody | GA5 | 3670S | |
| Incubator shaker | New Brunswik Scientific | Innova 42 | |
| L929 cell line | ATCC | NCTC clone 929 [L cell, L-929, derivative of Strain L] (ATCC CCL-1) | |
| Laminar air flow | Thermo Fsiher Scientific | 1386 | |
| Magnesium chloride | Himedia | MB040 | |
| Monosodium phosphate | Merck | 567545 | |
| Nutrient Mixture F-12 Ham Medium | Himedia | Al106S | |
| Petri dish | Duran Group | 237554805 | |
| Phosphate buffered saline | Himedia | ML023 | |
| Potassium chloride | Himedia | MB043 | |
| Serological pipette | Labware | LW-SP1010 | |
| Sodium bicarbonate | Himedia | MB045 | |
| Sucrose | Himedia | MB025 | |
| Syringe filter (0.2μ, 25 mm diameter) | Axiva | SFPV25R | |
| T-25 tissue culture flasks suitable for adherent cell culture. | Himedia | TCG4-20X10NO | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200-056 |
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