الحصول على ميكروجليا الإنسان من أنسجة الدماغ البشري الكبار
Summary
هذا البروتوكول هو وسيلة فعالة وفعالة من حيث التكلفة وقوية لعزل microglia الأولية من العيش، والكبار، أنسجة الدماغ البشرية. يمكن أن تكون ميكروجليا الإنسان المعزولة أداة لدراسة العمليات الخلوية في التوازن والمرض.
Abstract
Microglia هي الخلايا المناعية الفطرية المقيمة في الجهاز العصبي المركزي (CNS). تلعب Microglia دورًا حاسمًا أثناء التطوير ، وفي الحفاظ على التوازن ، وأثناء الإصابة أو العدوى. وقد سلطت عدة مجموعات بحثية مستقلة الضوء على الدور المركزي الذي تلعبه المايكجليا في أمراض المناعة الذاتية، ومتلازمات المناعة الذاتية والسرطانات. قد يؤدي تنشيط الوميكروجليا في بعض الأمراض العصبية إلى المشاركة مباشرة في العمليات المسببة للأمراض. microglia الأولية هي أداة قوية لفهم الاستجابات المناعية في الدماغ، والتفاعلات الخلية الخلية والأنماط الظاهرية microglia dysregulated في المرض. ميكروجليا الأولية تقليد في خصائص ميكروجليال الجسم الحي أفضل من خطوط الخلايا الصغيرة الخالدة. تظهر ميكروجليا الإنسان الكبار خصائص متميزة بالمقارنة مع الجنين البشري والقوارض microglia. يوفر هذا البروتوكول طريقة فعالة لعزل ميكروجليا الأولية عن الدماغ البشري البالغ. دراسة هذه microglia يمكن أن توفر رؤى حاسمة في التفاعلات الخلية الخلية بين microglia وغيرها من السكان الخلوية المقيمين في الجهاز العصبي المركزي بما في ذلك، oligodendrocytes، الخلايا العصبية والخلايا الفلكية. بالإضافة إلى ذلك، قد تكون مثقفة microglia من أدمغة بشرية مختلفة لتوصيف الاستجابات المناعية الفريدة للطب الشخصي وعدد لا يحصى من التطبيقات العلاجية.
Introduction
تم بناء الجهاز العصبي المركزي (CNS) من شبكة معقدة من الخلايا العصبية والخلايا الدبقية1. بين الخلايا الدبقية، وظيفة microglia كالخلايا المناعية الفطرية من الجهاز العصبي المركزي2،3. Microglia هي المسؤولة عن الحفاظ على التوازن في الجهاز العصبي المركزي صحية4. Microglia تلعب أيضا دورا هاما في النمو العصبي، عن طريق تقليم نقاط الاشتباك العصبي2. Microglia هي مركزية في علم الفيزيولوجيا المرضية من عدة أمراض عصبية بما في ذلك ولكن لا تقتصر على; مرض الزهايمر5, مرض باركنسون6, السكتة الدماغية7, التصلب المتعدد8, إصابة الدماغ الرضية9, آلام الأعصاب10, إصابة الحبل الشوكي11 وأورام الدماغ مثل الأورام الدبقية12.
الدراسات المتعلقة بالسوستاسيس CNS والأمراض استخدام microglia القوارض بسبب ندرة كفاءة التكلفة والوقت كفاءة الإنسان microglia بروتوكولات العزلة الأساسية13. القوارض microglia تشبه microglia الإنسان الأولية في التعبير عن الجينات مثل Iba-1، PU.1، DAP12 ومستقبلات M-CSF وكانت فعالة في فهم الدماغ العادي وكذلك المريض13. ومن المثير للاهتمام، والتعبير عن العديد من الجينات المناعية ذات الصلة مثل TLR4، MHC الثاني، Siglec-11 وسيجلج-3 يختلف بين الإنسان والقوارض microglia13. التعبير عن العديد من الجينات يختلف أيضا في التعبير الصدغي والأمراض العصبية في كلا النوعين14,15. هذه الاختلافات الكبيرة تجعل من ميكروجليا الإنسان نموذجا أساسيا لدراسة وظيفة microglia في التوازن والمرض. يمكن أن تكون ميكروجليا الإنسان الأولية أيضا أداة فعالة للفحص قبل الإكلينيكي للمرشحين المحتملين المخدرات16. وتؤكد الأسباب المذكورة أعلاه الحاجة المتزايدة إلى بروتوكولات فعالة من حيث التكلفة لعزل الغليا البشري الأولي.
لقد وضعنا بروتوكول لعزل ميكروليا الإنسان الأولية من أنسجة الدماغ البشرية الكبار التي تم جمعها نتيجة نافذة جراحية تم إنشاؤها لاستئصال الورم أو ال استئصالات جراحية أخرى. الأسلوب هنا يختلف بشكل كبير عن الأساليب الموجودة. تمكنا من عزل واستزراع الميكولا بعد مرور 75 دقيقة من موقع جمع الأنسجة إلى بدء بروتوكول العزل في المختبر. لقد استخدمنا سوبرات من الخلايا الليفية L929 لتعزيز نمو microglia معزولة. تركز هذه الطريقة على وجه التحديد على ثقافة وتطوير ميكروجليا الأولية فقط. الثقافة الناتجة عن إعداد حوالي 80٪ microglia. بينما البروتوكولات الأخرى توفر ثقافة غنية من microglia بالانقسام المركزي للانقسام الانحدار الكثافة ، cytometry التدفق والخرز المغناطيسي ، فإن البروتوكول هو طريقة سريعة وبسيطة وقوية وفعالة من حيث التكلفة لثقافة ميكروجليا الإنسان الأولية17،18،19،20. القدرة على استخدام جراحيا إزالة حية أنسجة المخ الكبار بدلا من أنسجة الدماغ الثابتة من الجثث يثبت ميزة إضافية من هذه الطريقة على النقيض من الإجراءات القائمة18,21.
Protocol
Representative Results
Discussion
Microglia ضمان التوازن في الدماغ العادي وتلعب أدوارا مركزية في علم الفيزيولوجيا المرضية من مختلف الأمراض العصبية4. Microglia هي مركزية لنماء الأعصاب وتشكيل نقاط الاشتباك العصبي2. وقد أثبتت الدراسات microglial محوري في فهم تطور وتطور الأمراض العصبية المتنوعة4. microg…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تأسيس مختبر SJ بمنح مؤسسية من IITJ ويتم تمويله من خلال منح من إدارة التكنولوجيا الحيوية (BT/PR12831/MED/30/1489/2015) ووزارة الإلكترونيات وتكنولوجيا المعلومات الحكومية في الهند (No.4(16)/2019-ITEA). تم الحصول على أقسام أنسجة الدماغ البشري من معهد عموم الهند للعلوم الطبية (AIIMS) جودبور بعد موافقة لجنة الأخلاقيات المؤسسية. نشكر مايانك راثور، عضو B.Tech Student في جمعية التصميم والفنون IIT Jodhpur، لدعم التصوير بالفيديو.
Materials
| Antibiotic-Antimycotic solution | Himedia | A002 | |
| Calcium chloride | Sigma | 223506 | |
| Centrifuge (4 °C) | Sigma | 146532 | |
| Centrifuge tubes | Abdos | P10203 | |
| CO2 incubator | New Brunswik | Galaxy 170 S | |
| D-Glucose | Himedia | GRM077 | |
| DMEM medium with glutamine | Himedia | AL007S | |
| Fetal bovine serum | Himedia | RM9955 | |
| Flacon tube (50 ml) | Thermo Fsiher Scientific | 50CD1058 | |
| Fluorescein Ricinus communis agglutinin-1 | Vector | FL-1081 | |
| Fluorescent microscope | Leica | DM2000LED | |
| Fluoroshield with DAPI | Sigma | F6057 | |
| GFAP antibody | GA5 | 3670S | |
| Incubator shaker | New Brunswik Scientific | Innova 42 | |
| L929 cell line | ATCC | NCTC clone 929 [L cell, L-929, derivative of Strain L] (ATCC CCL-1) | |
| Laminar air flow | Thermo Fsiher Scientific | 1386 | |
| Magnesium chloride | Himedia | MB040 | |
| Monosodium phosphate | Merck | 567545 | |
| Nutrient Mixture F-12 Ham Medium | Himedia | Al106S | |
| Petri dish | Duran Group | 237554805 | |
| Phosphate buffered saline | Himedia | ML023 | |
| Potassium chloride | Himedia | MB043 | |
| Serological pipette | Labware | LW-SP1010 | |
| Sodium bicarbonate | Himedia | MB045 | |
| Sucrose | Himedia | MB025 | |
| Syringe filter (0.2μ, 25 mm diameter) | Axiva | SFPV25R | |
| T-25 tissue culture flasks suitable for adherent cell culture. | Himedia | TCG4-20X10NO | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200-056 |
References
- Allen, N. J., Barres, B. A. Glia – more than just brain glue. Nature. 457 (7230), 675-677 (2009).
- Lenz, K. M., Nelson, L. H. Microglia and Beyond: Innate Immune Cells As Regulators of Brain Development and Behavioral Function. Frontiers in Immunology. 9 (698), (2018).
- Gordon, S., Plüddemann, A., Martinez Estrada, F. Macrophage heterogeneity in tissues: phenotypic diversity and functions. Immunological Reviews. 262 (1), 36-55 (2014).
- Li, Q., Barres, B. A. Microglia and macrophages in brain homeostasis and disease. Nature Reviews Immunology. 18 (4), 225-242 (2018).
- Hansen, D. V., Hanson, J. E., Sheng, M. Microglia in Alzheimer’s disease: A microglial conundrum. Journal of Cell Biology. 217 (2), 459-472 (2017).
- Tremblay, M. -. E., Cookson, M. R., Civiero, L. Glial phagocytic clearance in Parkinson’s disease. Molecular Neurodegeneration. 14 (1), 16 (2019).
- Qin, C., et al. Dual Functions of Microglia in Ischemic Stroke. Neuroscience Bulletin. 35 (5), 921-933 (2019).
- Voet, S., Prinz, M., van Loo, G. Microglia in Central Nervous System Inflammation and Multiple Sclerosis Pathology. Trends in Molecular Medicine. 25 (2), 112-123 (2019).
- Loane, D. J., Kumar, A. Microglia in the TBI brain: The good, the bad, and the dysregulated. Experimental Neurology. 275 (03), 316-327 (2016).
- Inoue, K., Tsuda, M. Microglia in neuropathic pain: cellular and molecular mechanisms and therapeutic potential. Nature Reviews Neuroscience. 19 (3), 138-152 (2018).
- Bellver-Landete, V., et al. Microglia are an essential component of the neuroprotective scar that forms after spinal cord injury. Nature Communications. 10 (1), 518 (2019).
- Gutmann, D. H., Kettenmann, H. Microglia/Brain Macrophages as Central Drivers of Brain Tumor Pathobiology. Neuron. 104 (3), 442-449 (2019).
- Smith, A. M., Dragunow, M. The human side of microglia. Trends in Neurosciences. 37 (3), 125-135 (2014).
- Galatro, T. F., et al. Transcriptomic analysis of purified human cortical microglia reveals age-associated changes. Nature Neuroscience. 20 (8), 1162-1171 (2017).
- Friedman, B. A., et al. Diverse Brain Myeloid Expression Profiles Reveal Distinct Microglial Activation States and Aspects of Alzheimer’s Disease Not Evident in Mouse Models. Cell Reports. 22 (3), 832-847 (2018).
- Rustenhoven, J., et al. PU.1 regulates Alzheimer’s disease-associated genes in primary human microglia. Molecular Neurodegeneration. 13 (1), 44 (2018).
- Sierra, A., Gottfried-Blackmore, A. C., McEwen, B. S., Bulloch, K. Microglia derived from aging mice exhibit an altered inflammatory profile. Glia. 55 (4), 412-424 (2007).
- Mizee, M. R., et al. Isolation of primary microglia from the human post-mortem brain: effects of ante- and post-mortem variables. Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 16 (2017).
- Rustenhoven, J., et al. Isolation of highly enriched primary human microglia for functional studies. Scientific Reports. 6 (1), 19371 (2016).
- Spaethling, J. M., et al. Primary Cell Culture of Live Neurosurgically Resected Aged Adult Human Brain Cells and Single Cell Transcriptomics. Cell Reports. 18 (3), 791-803 (2017).
- Olah, M., et al. An optimized protocol for the acute isolation of human microglia from autopsy brain samples. Glia. 60 (1), 96-111 (2012).
- Jha, S., et al. The Inflammasome Sensor, NLRP3, Regulates CNS Inflammation and Demyelination via Caspase-1 and Interleukin-18. The Journal of Neuroscience. 30 (47), 15811 (2010).
- Freeman, L., et al. NLR members NLRC4 and NLRP3 mediate sterile inflammasome activation in microglia and astrocytes. Journal of Experimental Medicine. 214 (5), 1351-1370 (2017).
- Plant, S. R., et al. Lymphotoxin beta receptor (Lt betaR): dual roles in demyelination and remyelination and successful therapeutic intervention using Lt betaR-Ig protein. The Journal of Neuroscience. 27 (28), 7429-7437 (2007).
- Arnett, H. A., et al. The Protective Role of Nitric Oxide in a Neurotoxicant- Induced Demyelinating Model. The Journal of Immunology. 168 (1), 427 (2002).
- Arnett, H. A., et al. TNFα promotes proliferation of oligodendrocyte progenitors and remyelination. Nature Neuroscience. 4 (11), 1116-1122 (2001).
- Trouplin, V., et al. Bone marrow-derived macrophage production. Journal of Visualized Experiments. (81), e50966 (2013).
- Boltz-Nitulescu, G., et al. Differentiation of Rat Bone Marrow Cells Into Macrophages Under the Influence of Mouse L929 Cell Supernatant. Journal of Leukocyte Biology. 41 (1), 83-91 (1987).
- Englen, M. D., Valdez, Y. E., Lehnert, N. M., Lehnert, B. E. Granulocyte/macrophage colony-stimulating factor is expressed and secreted in cultures of murine L929 cells. Journal of Immunological Methods. 184 (2), 281-283 (1995).
