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Bioengineering

Replicação biomimética da microestrutura da superfície raiz usando alteração da litografia macia

Published: August 05, 2020
doi:
10.3791/61437
, ,
1Institute of Plant Sciences,Agricultural Research Organization (Volcani Center), 2Agro-NanoTechnology and Advanced Materials Center,Agricultural Research Organization (Volcani Center)

Summary

A biomimética tem sido usada anteriormente como uma ferramenta para estudar interações folha-microrganismo. No entanto, não existe tal ferramenta para raízes. Aqui, desenvolvemos um protocolo para formar superfícies sintéticas imitando microestrutura de superfície raiz para o estudo de interações ambiente raiz.

Abstract

Biomimética é o uso de química e ciências materiais para imitar sistemas biológicos, especificamente estruturas biológicas, para uma melhor humanidade. Recentemente, superfícies biomiméticas que imitam a microestrutura da superfície da folha foram utilizadas para estudar os efeitos da microestrutura de folhas nas interações folha-ambiente. No entanto, não existe tal ferramenta para raízes. Desenvolvemos uma ferramenta que permite a mímica sintética da microestrutura da superfície radicular em uma superfície artificial. Contamos com o método de litografia macia, conhecido pela replicação da microestrutura da superfície da folha, usando um processo de duas etapas. O primeiro passo é o mais desafiador, pois envolve o tecido biológico. Aqui, utilizamos uma estratégia diferente de polímero e cura, contando com o forte, rígido, poliuretano, curado por UV para a moldagem da raiz. Isso nos permitiu alcançar uma imagem negativa confiável da microestrutura da superfície raiz, incluindo as características delicadas e desafiadoras, como os cabelos radiculares. Em seguida, usamos essa imagem negativa como modelo para alcançar a replicação da microestrutura da superfície raiz usando tanto o siloxano polidimtil bem estabelecido (PDMS) quanto um derivado de celulose, celulose etílico, que representa uma imitação mais próxima da raiz e que também pode ser degradada por enzimas de celulose secretadas por microrganismos. Esta plataforma recém-formada pode ser usada para estudar os efeitos microestruturais da superfície em interações root-microrganismo de forma semelhante ao que foi mostrado anteriormente nas folhas. Além disso, o sistema nos permite rastrear as localizações do microrganismo, em relação às características da superfície, e no futuro sua atividade, na forma de secreção de celulase.

Introduction

A replicação da microestrutura da superfície da folha é um método conhecido no campo de pesquisa de biomimética1,,2,,3,4. As primeiras replicações da microestrutura da superfície da folha foram realizadas utilizando esmalte e materiais de borracha aplicados na superfície da folha para melhor visualização da microestrutura, especificamente stomata5,,6,7,8,,9,10. O método foi então melhorado, e polímeros avançados foram usados para imitar microestrutura de superfície de folha utilizando litografia macia, especialmente no contexto da biomimética das superfícies super hidrofóbicas2,,3,4,,11,12. Nos últimos anos, esse método foi comprovado como uma ferramenta útil no estudo da interação entre a superfície da folha e os microrganismos residentes na superfície sejam patogênicos13,,14 ou benéficos, como parte da fisfera da folha natural15. A simplificação do sistema natural mostrou-se extremamente útil no estudo das interações super-microrganismos mesmo quando sistemas puramente sintéticos foram utilizados como superfícies15,,16,,17,,18.

Embora a replicação da microestrutura da superfície da folha tenha se mostrado uma ferramenta útil para estudar a interação que ocorre na superfície da folha com diferentes microrganismos, tal ferramenta não existe para raízes vegetais. As raízes das plantas são mais difíceis de estudar, pois residem abaixo do solo e todas as interações ocorrem dentro do solo. Semelhante às folhas, a microestrutura da superfície radicular provavelmente desempenhará um papel nas interações raiz-microrganismo. No entanto, atualmente não existe nenhum método para isolar o papel específico da microestrutura da superfície raiz nas complexas interações raiz-microrganismo. A característica microestrutural da superfície radicular mais estudada são os cabelos radiculares19,,20,21. Os cabelos radiculares têm um papel importante no aumento da área da superfície e por isso permitem uma ingestão mais eficiente de nutrientes e água22,no entanto seu envolvimento como característica estrutural nas interações raiz-microrganismo nunca foi testado.

O polímero mais utilizado para litografia macia nas folhas é o siloxano de polidimtila (PDMS). As propriedades do PDMS se assemelham às da cutícula da folha15,23. No entanto, nas raízes das plantas, o material mais abundante é acelulose 24,25 que tem propriedades diferentes das do PDMS26,,27,28. Usar o PDMS para construir uma plataforma sintética para estudar os efeitos da microestrutura superficial nas interações ambiente raiz é, portanto, menos do que o ideal.

O protocolo aqui apresentado permite a formação de réplica de microestrutura de superfície raiz sintética a partir de diversos materiais. Como o método de replicação da microestrutura da superfície da folha, este é um processo de duas etapas. O primeiro passo usa o tecido biológico (raiz) como fonte de moldagem em um molde de poliuretano (uma réplica negativa). O molde de poliuretano, que representa a imagem negativa da microestrutura da superfície raiz, pode então ser usado como base para gerar a replicação positiva da microestrutura da superfície raiz a partir de uma variedade de materiais, incluindo PDMS e derivados de celulose. Esta replicação da superfície radicular pode mais tarde ser usada como uma plataforma para entender o papel da estrutura da superfície nas interações raiz-microrganismo.

Protocol

1. Cultivando as plantas e preparação das raízes Opção 1: Prepare raízes aventuriosas a partir da haste. Leve uma bandeja de enraizamento para cultivar plantas. Encha a bandeja com solo. Adicione uma semente de cultivar de tomate M82 a cada célula da bandeja. Cubra as sementes com um pouco de solo. Rega a bandeja do fundo com um conta-gotas enquanto a água enche o fundo da bandeja e o solo absorve água. Adicione 2 mL de fertilizante por 1 L de água ao fundo da bandeja uma vez por semana. Cresça em uma câmara em crescimento a 25 °C. Use condições de iluminação de 9h de luz (7:00-16:00) alternadamente com 15 horas de escuridão. Depois de 3 semanas, remova a planta do solo. Corte o sistema radicular da planta no ponto de interação com a haste. Coloque a planta sem raízes em um béquer cheio de água. Depois de alguns dias, corte as raízes aventuriosas que emergem do caule e use-as para replicação. Opção 2: Prepare raízes germinantes de sementes. Molhe um papel filtro do tamanho de uma placa de Petri com água. Coloque várias sementes M82 (não mais de 10) no papel, dentro de uma placa de Petri. Incubar a placa a 25 °C. Hidrate o papel todos os dias. Depois que as raízes germinadas forem longas o suficiente (aproximadamente 5 dias), remova as sementes e use as raízes para replicação. 2. Preparação da réplica negativa da raiz do poliuretano Para gerar solução de réplica negativa, adicione 9,49 g de dimethacrilato de diuretano a um frasco de 20 mL. Adicione 1,45 mL de metacrilato etílico ao frasco. Mexa à temperatura ambiente (RT) até que a solução pareça clara e se torne homogênea.NOTA: Aproximadamente 2 h é suficiente para alcançar uma solução homogênea. Adicione 3 mL do plastificador, ftalato de dietilo e mexa por 1h no RT.NOTA: O ftalato de diethyl é miscível no monômero acrilato. Adicione 300 μL do iniciador fotográfico, 2-hidroxi-2-metilpropiofenona, e mexa durante a noite na RT. Continue mexendo até que todas as bolhas sejam removidas.NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui. A solução pode ser mantida na RT. Para gerar a réplica negativa da raiz, pegue um slide de vidro limpo e despeje 1 mL da solução de réplica negativa sobre ela. Coloque 2\u20123 raízes sobre a solução. Não permita que as raízes sejam totalmente cobertas pela solução. Mantenha o slide sob a lâmpada ultra violeta (UV) de 8 W por 8\u201210 min. Não mantenha a solução sob luz UV por muito tempo.NOTA: É importante não manter a solução sob a luz UV por muito tempo, pois torna o poliuretano muito rígido, tornando impossível remover a raiz. Desligue a lâmpada UV, remova a réplica do deslizamento de vidro e coloque-a em uma placa de Petri cheia de etanol, para remover o monômero não redigido. Para obter a réplica negativa, remova a raiz da réplica muito lentamente usando fórceps. 3. Prepare a réplica positiva raiz do PDMS. Para gerar a mistura para a réplica positiva, coloque 10 g de dimetil siloxano em um copo de papel. Adicione 1 g de agente de cura e misture bem. Mantenha a mistura em um desiccador sob vácuo por 2h para remover bolhas de ar. Para gerar a réplica positiva, coloque a réplica negativa de poliuretano em uma placa de Petri. Despeje a mistura PDMS em cima da réplica negativa. Aplique vácuo por 2h para garantir a cobertura da microestrutura. Mantenha a placa de Petri durante a noite na RT. Separe a réplica positiva curada da réplica negativa manualmente. 4. Prepare a réplica positiva da raiz da celulose etil. Para gerar a solução de celulose etílico, coloque 1,32 ml de pthalato de dietil como um plastificador em um copo de 100 ml. Adicione 20 mL de etanol e mexa no RT por 2h. Adicione 3,3 g de celulose etil e mexa durante a noite. Para gerar a réplica positiva, coloque a réplica negativa de poliuretano em uma placa de Petri. Despeje a solução de celulose etílico em cima da réplica negativa. Mantenha a placa de Petri durante a noite na RT sob o capô. Remova a réplica positiva da réplica negativa muito lentamente por fórceps.

Representative Results

Para formar a replicação da microestrutura da superfície radicular, uma raiz deve ser escolhida para a moldagem. Cultivamos plantas de tomate no solo, tornando o uso da raiz natural do sistema radicular extremamente desafiador. A remoção do solo do sistema radicular pode ser difícil e, além disso, as raízes do sistema radicular são frágeis e podem quebrar após tentativas de moldagem. Por isso, sugerimos primeiro usar raízes mais rígidas, para estabelecer o protocolo no laboratório. A formação dessas raízes é descrita na Figura 1A. O sistema radicular da planta é removido depois que a planta foi cultivada por 3 semanas e a planta sem raízes é colocada na água por cerca de uma semana até que raízes aventuriosas emerjam do caule. Essas raízes podem ser usadas para replicação durante o estabelecimento do protocolo. Uma vez que o protocolo tenha sido bem estabelecido, uma estrutura de superfície raiz mais realista é desejada. Aqui sugerimos evitar raízes cultivadas no solo como a remoção completa do solo em extremamente desafiador. Em vez disso, sugerimos o uso de raízes germinantes, fornecendo informações valiosas sobre a microestrutura da superfície raiz de uma planta geneticamente específica. O crescimento dessas raízes é descrito na Figura 1B. As sementes são colocadas em um papel filtro molhado e incubadas a 25 °C. Após aproximadamente 5 dias, durante os quais o papel filtro é mantido úmido, as raízes germinadas são longas o suficiente para a replicação. Essas raízes são mais frágeis do que as raízes sugeridas anteriormente e requerem cuidados mais delicados. A produção da réplica da microestrutura da superfície radicular é um processo de duas etapas. Na primeira etapa, a raiz natural está sendo moldada em um molde à base de poliuretano (a réplica negativa). A vantagem desta etapa é que todos os materiais para o molde de poliuretano estão sendo preparados e a raiz é colocada em cima da solução preparada na extremidade para uma exposição de 10 minutos ao UV. Como resultado, o tecido biológico não está exposto a condições adversas por muito tempo e pode ser manuseado suavemente no final do processo. Se todas as etapas do protocolo forem seguidas, uma boa réplica negativa será gerada. Esta réplica mostrará a estrutura celular da superfície radicular, bem como os orifícios representando a localização dos pelos radiculares(Figura 2A). Se algumas etapas críticas do protocolo não forem seguidas, o procedimento falhará. Um desses passos é a colocação da raiz na solução de poliuretano antes da cura. A raiz deve ser colocada muito suavemente para evitar a submersão dela na solução de poliuretano. Tal submersão, de qualquer parte da raiz, causará a armadilha da raiz no polímero duro sem capacidade de removê-lo. Se tal evento ocorrer, a raiz permanecerá dentro da réplica negativa após sua cura(Figura 2B). Outro passo crucial é em relação ao tempo de cura por luz UV. O tempo de cura recomendado é de 8\u201210 min. Passar dos 10 minutos resultará em um molde de poliuretano extremamente duro, tornando impossível remover a raiz sem quebrá-la dentro do molde de poliuretano. A quebra da raiz às vezes pode ser visível a olho nu, por exemplo, quando uma peça grande é quebrada(Figura 2C, topo, marcada com setas roxas). No entanto, às vezes pequenas peças de raiz são deixadas no material que são difíceis de detectar a olho nu e um microscópio tem que ser usado(Figura 2C, inferior, marcado com setas roxas). Recomendamos examinar cuidadosamente a réplica negativa de poliuretano com um microscópio antes da continuação do protocolo para garantir que nenhuma raiz residual esteja presente. Uma vez que a réplica negativa do poliuretano esteja preparada; muitos materiais podem ser usados para a preparação da réplica positiva. A preparação da réplica positiva, usando a réplica negativa de poliuretano como molde, é direta e depende completamente da qualidade da réplica negativa do poliuretano. Para gerar a réplica positiva, utilizamos tanto pdms — como é bem conhecido no campo da litografia macia (Figura 3A)— quanto na celulose etílico como um material que imita melhor as propriedades da superfície radicular que é composta principalmente decelulose (Figura 3B). A imagem SEM da réplica do PDMS mostra os cabelos raiz muito claramente. Os cabelos estão na zona de alongamento, onde começam a emergir. Assim, o comprimento dos pelos radiculares varia ao longo da superfície radicular à medida que se tornam mais longos, muito parecidos com na raiz natural (Figura 3A). A celulose etil gera um filme mais duro e menos flexível que o PDMS. Assim, a remoção dele do molde negativo requer mais cuidado. No entanto, alguns cabelos e a microestrutura superficial são visíveis sob o microscópio de luz(Figura 3B). Usamos esses dois materiais para gerar a réplica positiva, no entanto, qualquer material que possa formar um filme será um bom candidato para a réplica positiva, usando a réplica negativa de poliuretano. Figura 1: Raízes de plantas de tomate para replicação. (A) Uma planta de tomate (M82) é cultivada a 25 °C com 9h de luz e 15h de escuridão. Após 3 semanas, a planta é removida do solo e o sistema radicular é cortado. A planta sem raízes é colocada na água até que raízes aventuriosas emerjam do caule após cerca de uma semana. Essas raízes não mostram a estrutura exata como as raízes do sistema radicular, mas representam um bom modelo. Essas raízes são menos frágeis do que as raízes do sistema radicular e, portanto, são preferidas para trabalhar ao estabelecer a técnica em laboratório. (B) As sementes de tomate (M82) são colocadas em um papel filtro molhado em uma placa de Petri e incubadas a 25 °C. O papel é hidratado todos os dias e as sementes estão germinando. As raízes estão crescendo e depois de aproximadamente 5 dias são tempo suficiente para serem usadas para replicação. Essas raízes são mais suaves e devem ser usadas uma vez que o método esteja bem estabelecido. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 2: Imagens de microscopia da réplica negativa de poliuretano. (A) Imagem SEM da réplica negativa de poliuretano feita de acordo com um protocolo seguindo todas as etapas. A estrutura celular é claramente visível. Setas amarelas apontam para buracos formados pelos cabelos na raiz. (B) Imagens de microscopia leve de réplica negativa de poliuretano com uma raiz dentro dela, pois estava totalmente coberta com a solução e a remoção dela era impossível. O poliuretano negativo foi curado com a raiz dentro. A raiz é visível pelos olhos e usa microscopia de luz. É impossível remover esta raiz da réplica curada. (C) Imagens de microscopia leve da réplica negativa de poliuretano que foi mantida sob luz UV por muito tempo. Como resultado, a raiz não poderia ser totalmente removida do polímero com grandes partículas visíveis pelo olho (imagem superior, marcada com setas roxas) ou pequenas frações visíveis apenas pelo microscópio (imagem inferior, marcada com setas roxas). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 3: Imagens de microscópio de réplica positiva. (A) Micrografia SEM de uma réplica positiva feita de PDMS. O alargamento mostra pelos de raiz. (B) Imagens de microscopia leve de uma réplica positiva feita de celulose etílico. Os cabelos são mostrados nas imagens à direita, enquanto a textura da superfície é visível na imagem à esquerda. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

Apresentamos um novo método para a replicação da microestrutura da superfície radicular. Este método se baseia nos métodos existentes de replicação da microestrutura da superfície da folha4. Para desenvolver esse método, tivemos que ajustar o método existente para as folhas. Percebemos que o passo problemático na cópia do método de replicação da folha em raízes envolve o primeiro passo da moldagem da raiz. Esta é a parte mais sensível do método, pois envolve o tecido biológico. Como resultado, queríamos escolher um polímero que exigisse condições relativamente suaves para a cura e, portanto, causasse danos mínimos ao tecido biológico. Escolhemos poliuretano porque pode ser polimerizado rapidamente (dentro de 10 minutos) sob luz UV29. Além disso, é muito difícil uma vez polimerizado30 e esperávamos que esta propriedade permitisse a remoção relativamente fácil da raiz do molde de poliuretano.

O método apresentado é uma abordagem de duas etapas na qual a imagem negativa (réplica negativa) é formada na primeira etapa e a replicação é formada na segunda etapa, com base na réplica negativa. Isso amplia a gama de materiais com os qual podemos trabalhar. A replicação da microestrutura da superfície da folha foi realizada principalmente em PDMS ou materiais epóxi11,31. Alguns trabalhos foram feitos com outros materiais, especificamente materiais que suportam o crescimento do microrganismo13,32. Isso porque nos últimos anos este método tem sido usado para estudar interações microrganismo-superfície no contexto da estrutura da superfície da folha. No entanto, nenhum material semelhante à celulose tem sido utilizado neste método no contexto das folhas. Sugerimos o uso de uma réplica negativa de poliuretano como molde e uma variedade de materiais para a réplica positiva. Em outras palavras, fazer a réplica positiva, de uma variedade de materiais, é relativamente fácil uma vez que uma boa réplica negativa é feita. Atualmente usamos derivados de celulose, mas estamos explorando as possibilidades de usar materiais mais relevantes para a superfície radicular, como pectina e lignina33,34 em combinação com derivados de celulose.

O método também se expande sobre o método existente de replicação da microestrutura da superfície da folha, uma vez que a folha é uma superfície 2D, enquanto a superfície raiz é curva e, portanto, é uma superfície 3D. Nosso método não permite a replicação de toda a superfície, uma vez que incorporar toda a raiz na solução de poliuretano não permite sua liberação. Portanto, um lado da raiz deve ser escolhido ao replicar a microestrutura da superfície raiz. A superfície sintética gerada é curva e representa aproximadamente metade da superfície, mas não toda. Nossa suposição é que as características estruturais da superfície raiz são principalmente simétricas sobre o eixo ao longo do comprimento da raiz. No entanto, em estudos onde tal simetria não é assumida, deve-se ter cuidado para escolher a raiz lateral apropriada para se replicar.

Apresentamos duas opções de raízes para serem usadas como moldes. A primeira é a opção de raízes aventuriosas cultivadas a partir do caule e a segunda é a opção de raízes germinadas no papel. A primeira opção visa principalmente auxiliar os pesquisadores na prática do método, pois essas raízes são mais robustas e fáceis de trabalhar. A segunda opção representa as diferenças genéticas que podem ser encontradas entre raízes de diferentes cultivares, independentemente das condições ambientais. Essas superfícies podem ser usadas como importantes ferramentas de pesquisa, porém, deve-se estar ciente de que o ambiente pode ter uma forte influência na estrutura da superfície radicular, especificamente no solo em que as raízes são cultivadas35,36. Devido ao estresse mecânico infligido pelo solo, algumas alterações morfológicas estão prestes a acontecer, além de feridas acumuladas na superfície à medida que a raiz penetra no solo37. A remoção de raízes do solo, bem como limpá-las, sem danificar sua estrutura é uma tarefa muito difícil. Portanto, não estamos otimistas quanto à capacidade de usar este método para imitar de forma confiável a microestrutura da superfície raiz das raízes cultivadas no solo. No entanto, para pesquisas que se concentram em diferenças genéticas ou ambientais onde a mudança na microestrutura é visivelmente clara, este método pode ser usado como uma ferramenta para estudar a influência da microestrutura da superfície raiz.

Nosso método produz uma superfície inerte imitando apenas as propriedades microestruturais da superfície raiz. Embora este método seja projetado para separar os efeitos estruturais nas interações root-environment de todos os outros efeitos, não podemos ignorar os compostos químicos nessas interações. Alguns microrganismos podem não sobreviver ou funcionar na superfície sem a adição de compostos, especificamente nutrientes. O próximo passo no desenvolvimento desta plataforma será a adição controlada de compostos químicos para estudar seus efeitos sobre as diferentes interações quando combinados com estrutura.

Este método foi desenvolvido como um primeiro passo no desenvolvimento de uma plataforma sintética para estudar interações raiz-microrganismo. Aqui imitamos a microestrutura da superfície raiz e esta plataforma inicial pode ser usada para estudar a influência da microestrutura superficial no comportamento dos microrganismos. No entanto, esta plataforma é limitada, pois não tem muitos outros elementos do sistema natural. Esta plataforma deve ser ainda mais desenvolvida com o uso dos materiais certos para gerar a superfície e com a adição de outros produtos químicos, críticos e críticos no sistema. Em uma plataforma mais avançada, também podemos imaginar a distribuição espacial dos produtos químicos. No entanto, como atualmente não existe nenhum outro método para isolar efeitos estruturais nas interações root-microorganism, esperamos que os pesquisadores possam usar essa plataforma inicial para fazer perguntas específicas da estrutura nessas interações.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

A pesquisa foi apoiada por fundos de sementes da Organização de Pesquisa Agrícola para mk.

Materials

2-hydroxy-2-methylpropiophenone Sigma 405655
Diethyl phthalate Across 114520010
Diurethane dimetharylate Sigma 436909
Ethyl cellulose Across 232705000
Ethyl methacrylate Sigma 234893
Shaphir Solution GAT fertilizer 6-2-4
Sylgard 184 kit Polymer-G 510018400500
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Kumari, P., Sayas, T., Kleiman, M. Biomimetic Replication of Root Surface Microstructure using Alteration of Soft Lithography. J. Vis. Exp. (162), e61437, doi:10.3791/61437 (2020).
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