軟リソグラフィの改変を用いた根表面微細構造の生物模倣複製

根表面の微細構造複製を形成するには、成形用にルートを選択する必要があります。私たちは土壌中のトマト植物を栽培し、根系の天然根を利用することは非常に困難です。根系からの土の除去は困難であり、さらに根系根は壊れやすく、成形の試み時に壊れる可能性があります。したがって、まず、より堅い根を使用して、ラボでプロトコルを確立することをお勧めします。このような根の形成は図1Aに記載されている。植物根系は、植物が3週間成長した後に除去され、根のない植物は、茎から出現する根が出てくるまで約1週間水中に置かれる。これらのルートは、プロトコルの確立中にレプリケーションに使用できます。プロトコルが確立されたら、より現実的なルートサーフェス構造が望まれる。ここでは、非常に困難な土壌の完全な除去として土壌で成長した根を避けることをお勧めします。代わりに、遺伝的に特定の植物の根表面微細構造に関する貴重な情報を提供し、発芽根の使用を提案する。このような根の成長は図1Bに記載されています。種子は、湿ったフィルター紙の上に置かれ、25°Cでインキュベートされます。約5日後、濾紙が湿った状態に保たれ、発芽した根は複製に十分な長さになる。これらの根は、以前に提案された根よりも脆弱であり、より繊細なケアを必要とします。 根表面微細構造レプリカの製造は、2段階のプロセスです。最初のステップでは、天然根はポリウレタンベースの金型(負のレプリカ)に成形されています。このステップの利点は、ポリウレタン型のすべての材料が準備され、ルートがUVへの10分の露出のために最後に調製された溶液の上に置かれているということです。その結果、生体組織は過酷な条件にさらされすぎて、プロセスの最後に穏やかに処理することができます。すべてのプロトコル・ステップに従えば、良好なネガティブ・レプリカが生成されます。このレプリカには、ルート サーフェスのセル構造と、根ヘアの位置を表す穴が表示されます (図 2A)。プロトコルの重要な手順が実行されない場合、その手順は失敗します。そのようなステップの1つは、硬化前のポリウレタン溶液上の根の配置である。ポリウレタン溶液中の水没を避けるために、根は非常に穏やかに配置されなければならない。このような水没は、根の任意の部分の、それを除去する能力を持たない硬いポリマー中の根の封じ込めを引き起こす。このようなイベントが発生した場合、ルートは、削除後も負のレプリカ内に残ります (図 2B)。もう一つの重要なステップは、UV光による硬化時間に関することです。推奨硬化時間は8\u201210分です。10分を過ぎると非常に硬いポリウレタン型が発生し、ポリウレタン型の中で根を壊さずに取り除かれなくなります。大きな部分が壊れたときなど、根の破損は肉眼で見えることがあります(図2C、上、紫色の矢印でマーク)。しかし、肉眼で見つけにくい材料に小さな根片が残り、顕微鏡を使用しなければならない場合があります(図2C、下、紫色の矢印でマーク)。プロトコルの継続前にポリウレタン陰性レプリカを顕微鏡で慎重に調べ、残留根がないことを確認することをお勧めします。 ポリウレタンネガティブレプリカが準備されると、多くの材料は、ポジティブなレプリカの調製に使用することができます。正のレプリカの調製は、ポリウレタンネガティブレプリカを金型として使用し、まっすぐ進み、ポリウレタンネガティブレプリカの品質に完全に依存します。正のレプリカを生成するために、ソフトリソグラフィ(図3A)の分野でよく知られているPDMSと、主にセルロースで構成される根表面の特性をよりよく模倣する材料としてエチルセルロースの両方を使用しました(図3B)。PDMS レプリカの SEM イメージは、根ヘアを非常に明確に示しています。毛は伸び帯にあり、そこから現れ始めます。したがって、根のヘアの長さは、自然なルートのように長くなるにつれて、根の表面に沿って変化します(図3A)。エチルセルロースはPDMSよりも硬く、柔軟性の低いフィルムを生成します。したがって、負の金型から除去するには、より多くの注意が必要です。しかし、一部の毛髪および表面微細構造は、光顕微鏡下で見える(図3B)。これらの2つの材料を使用して正のレプリカを生成したが、フィルムを形成できる材料は、ポリウレタンネガティブレプリカを使用して、陽性レプリカの良い候補となるだろう。 図1:複製用のトマト植物の根。(A)トマト(M82)植物は、光の9時間と15時間の暗闇で25°Cで栽培されています。3週間後、植物は土壌から取り除かれ、根系は遮断される。根のない植物は、約1週間後に茎から出現する根が出てくるまで水に入れられます。これらのルートは、ルート システムからのルートとして正確な構造を示すわけではありませんが、優れたモデルを表します。これらのルートはルート システム ルートよりも脆弱ではないため、ラボでの技術の確立時に使用することが推奨されます。(B)トマト(M82)種子はペトリ皿に湿ったフィルター紙に入れ、25°Cでインキュベートする。紙は毎日水分補給され、種子は発芽しています。根は増大しており、約5日後にはレプリケーションに使用できる長さになります。これらの根は穏やかで、メソッドが確立されたら使用する必要があります。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 図2:ポリウレタン陰性レプリカの顕微鏡画像(A) すべての手順に従うプロトコルに従って作られたポリウレタンネガティブレプリカのSEM画像。細胞構造がはっきりと見える。黄色の矢印は、根の毛によって形成された穴を指します。(B)ポリウレタンネガティブレプリカの光顕微鏡画像は、溶液で完全に覆われていて、それを除去することは不可能であった。ポリウレタン陰性を、根を内部で硬化させた。根は目で見ることができ、光顕微鏡を用いる。このルートを、硬化したレプリカから削除することは不可能です。(C)UV光下に長時間保存されていたポリウレタン陰性レプリカの光顕微鏡画像。その結果、重層は、大きな粒子が目で見える(上の画像、紫色の矢印でマークされている)、または顕微鏡でのみ見える小さな分数(紫色の矢印でマークされた下の画像)のいずれかでポリマーから完全に除去することができませんでした。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 図3:陽性レプリカの顕微鏡画像。(A) PDMSから作られたポジティブレプリカのSEM顕微鏡写真。拡大は根の毛を示す。(B)エチルセルロースから作られた陽性レプリカの光顕微鏡画像。ヘアは右側の画像に表示され、サーフェス テクスチャは左側のイメージに表示されます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。