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Bioengineering

Réplication biomimétique de la microstructure de surface racine à l’aide de l’altération de la lithographie douce

Published: August 05, 2020
doi:
10.3791/61437
, ,
1Institute of Plant Sciences,Agricultural Research Organization (Volcani Center), 2Agro-NanoTechnology and Advanced Materials Center,Agricultural Research Organization (Volcani Center)

Summary

La biomimétique a déjà été utilisée comme outil pour étudier les interactions feuille-micro-organismes. Cependant, aucun outil de ce genre n’existe pour les racines. Ici, nous développons un protocole pour former des surfaces synthétiques imitant la microstructure de surface de racine pour l’étude des interactions racine-environnement.

Abstract

La biomimétique est l’utilisation de la chimie et des sciences des matériaux pour imiter les systèmes biologiques, en particulier les structures biologiques, pour améliorer l’humanité. Récemment, des surfaces biomimétiques imitant la microstructure de la surface des feuilles ont été utilisées pour étudier les effets de la microstructure des feuilles sur les interactions feuille-environnement. Cependant, aucun outil de ce genre n’existe pour les racines. Nous avons développé un outil permettant le mimétisme synthétique de la microstructure de surface de racine dans une surface artificielle. Nous nous sommes appuyés sur la méthode de lithographie douce, connue pour la réplication de la microstructure de la surface des feuilles, à l’aide d’un processus en deux étapes. La première étape est la plus difficile car elle implique le tissu biologique. Ici, nous avons utilisé un polymère différent et la stratégie de durcissement, en s’appuyant sur le fort, rigide, polyuréthane, guéri par les UV pour le moulage des racines. Cela nous a permis d’obtenir une image négative fiable de la microstructure de la surface de la racine, y compris les caractéristiques délicates et difficiles telles que les poils racinaires. Nous avons ensuite utilisé cette image négative comme un modèle pour atteindre la réplication de la microstructure de surface de racine en utilisant à la fois le siloxane polydiméthylique bien établi (PDMS) ainsi qu’un dérivé de cellulose, cellulose éthylique, qui représente un imitation plus proche de la racine et qui peut également être dégradée par des enzymes cellulase sécrétées par des micro-organismes. Cette plate-forme nouvellement formée peut être utilisée pour étudier les effets microstructuraux de la surface dans les interactions racine-micro-micro-micro-organisme d’une manière similaire à ce qui a été précédemment montré dans les feuilles. En outre, le système nous permet de suivre l’emplacement du micro-organisme, par rapport aux caractéristiques de surface, et à l’avenir son activité, sous forme de sécrétion de cellulase.

Introduction

La réplication de la microstructure de surface des feuilles est une méthode connue dans le domaine de recherche biomimétique1,2,3,4. Les premières reproductions de la microstructure de surface de feuille ont été effectuées à l’aide de vernis à ongles et de matériaux en caoutchouc appliqués sur la surface des feuilles pour une meilleure visualisation de la microstructure, en particulier les stomates5,6,7,8,9,10. La méthode a ensuite été améliorée, et des polymères avancés ont été utilisés pour imiter la microstructure de la surface des feuilles en utilisant la lithographie douce, en particulier dans le contexte de la biomimétique des surfaces super hydrophobes2,3,4,11,12. Ces dernières années, cette méthode a été prouvée comme un outil utile dans l’étude de l’interaction entre la surface des feuilles et les micro-organismes résidant à la surface, qu’ils soient pathogènes13,14 ou bénéfiques, dans le cadre de la phyllosphère naturelle des feuilles15. La simplification du système naturel s’est avérée extrêmement utile dans l’étude des interactions surface-micro-organismes, même lorsque des systèmes purement synthétiques ont été utilisés comme surfaces15,16,17,18.

Bien que la réplication de la microstructure de la surface des feuilles se soit avérée un outil utile pour étudier l’interaction qui se produit à la surface de la feuille avec différents micro-organismes, il n’existe pas d’outil de ce genre pour les racines des plantes. Les racines des plantes sont plus difficiles à étudier puisqu’elles résident sous le sol et que toutes les interactions se produisent dans le sol. Semblable aux feuilles, la microstructure de surface de racine est susceptible de jouer un rôle dans les interactions racine-micro-micro-micro-organisme. Toutefois, il n’existe actuellement aucune méthode permettant d’isoler le rôle spécifique de la microstructure de la surface des racines dans les interactions complexes entre les racines et les micro-organismes. La caractéristique microstructurale de surface racinaire la plus étudiée est les poils racinaires19,20,21. Les poils racinaires ont un rôle important à jouer dans l’augmentation de la surface et en permettant une consommation plus efficace de nutriments et d’eau22,mais leur implication en tant que caractéristique structurelle dans les interactions racine-micro-micro-micro-organisme n’a jamais été testée.

Le polymère le plus utilisé pour la lithographie molle dans les feuilles est le siloxane polydiméthyle (PDMS). Les propriétés de PDMS ressemblent à celles de la cuticule de feuille15,23. Cependant, dans les racines des plantes, le matériau le plus abondant est la cellulose24,25 qui a des propriétés différentes de celles de PDMS26,27,28. L’utilisation de PDMS pour construire une plate-forme synthétique pour étudier les effets de la microstructure de surface dans les interactions racine-environnement est donc loin d’être idéale.

Le protocole présenté ici permet la formation d’une microstructure de surface de racine synthétique à partir de divers matériaux. Comme la méthode de réplication de la microstructure de surface des feuilles, il s’agit d’un processus en deux étapes. La première étape utilise le tissu biologique (racine) comme source de moulage dans un moule en polyuréthane (une réplique négative). Le moule en polyuréthane, qui représente l’image négative de la microstructure de la surface de la racine, peut ensuite être utilisé comme base pour générer la réplication positive de la microstructure de surface de racine à partir d’une variété de matériaux, y compris pdms et dérivés de la cellulose. Cette réplication de surface racine peut ensuite être utilisée comme plate-forme pour comprendre le rôle de structure de surface dans les interactions racine-micro-micro-micro-organisme.

Protocol

1. Cultiver les plantes et la préparation des racines Option 1 : Préparer les racines adventieuses à partir de la tige. Prenez un plateau d’enracinement pour la culture des plantes. Remplissez le plateau de terre. Ajouter une graine de cultivar de tomates M82 à chaque cellule du plateau. Couvrir les graines d’un peu de terre. Arrosez le plateau du fond avec un goutte-à-goutte pendant que l’eau remplit le fond du plateau et que le sol absorbe l’eau. Ajouter 2 mL d’engrais par 1 L d’eau au fond du plateau une fois par semaine. Poussez dans une chambre de culture à 25 °C. Utilisation des conditions d’éclairage de 9 h de lumière (7:00-16:00) alternée avec 15 h d’obscurité. Après 3 semaines retirer la plante du sol. Couper le système racinaire de la plante au point d’interaction avec la tige. Mettre la plante sans racines dans un bécher rempli d’eau. Après quelques jours, couper les racines adventious qui émergent de la tige et les utiliser pour la réplication. Option 2 : Préparer les racines germinales des graines. Mouiller un papier filtre de la taille d’une boîte de Pétri avec de l’eau. Mettre plusieurs graines de M82 (pas plus de 10) sur le papier, à l’intérieur d’une boîte de Pétri. Incuber la plaque à 25 °C. Hydratez le papier tous les jours. Après que les racines germées sont assez longues (environ 5 jours), retirez les graines et utilisez les racines pour la réplication. 2. Préparation de la réplique négative racine du polyuréthane Pour générer une solution de réplica négative, ajoutez 9,49 g de diuréthane diméthacrylate à un flacon de 20 mL. Ajouter 1,45 mL de méthacrylate d’éthyle au flacon. Remuer à température ambiante (RT) jusqu’à ce que la solution semble claire et devienne homogène.REMARQUE : Environ 2 h suffisent pour parvenir à une solution homogène. Ajouter 3 mL de plastifiant, phtalate de diéthyle, et remuer pendant 1 h à RT.REMARQUE : Le phtalate de diéthyle est miscible dans le monomère acrylate. Ajouter 300 μL de l’initiatrice photo, 2-hydroxy-2-méthylpropiophénone, et remuer toute la nuit à RT. Continuer à remuer jusqu’à ce que toutes les bulles soient enlevées.REMARQUE : Le protocole peut être mis en pause ici. La solution peut être conservée à RT. Pour générer le réplica négatif de la racine, prenez une diapositive de verre propre et versez 1 mL de la solution de réplica négative sur elle. Placez les racines 2\u20123 sur la solution. Ne laissez pas les racines être entièrement couvertes par la solution. Gardez la lame sous la lampe ultra-violette (UV) de 8 W pendant 8\u201210 min. Ne gardez pas la solution sous la lumière UV trop longtemps.REMARQUE : Il est important de ne pas garder la solution sous la lumière UV trop longtemps car elle rend le polyuréthane trop dur, ce qui rend impossible d’enlever la racine. Éteignez la lampe UV, retirez le réplique de la lame de verre et mettez-la dans une boîte de Pétri remplie d’éthanol, pour enlever le monomère non expurgé. Pour obtenir le réplica négatif, retirez la racine du réplica très lentement à l’aide de forceps. 3. Préparez le réplica positif racine de PDMS. Pour générer le mélange pour la réplique positive, placez 10 g de siloxane de diméthyle dans une tasse de papier. Ajouter 1 g d’agent de durcissement et bien mélanger. Garder le mélange dans un dessiccateur sous vide pendant 2 h pour enlever les bulles d’air. Pour générer la réplique positive, placez la réplique négative en polyuréthane dans une boîte de Pétri. Verser le mélange PDMS sur le dessus de la réplique négative. Appliquer le vide pendant 2 h pour assurer la couverture de la microstructure. Gardez la boîte de Pétri toute la nuit à RT. Séparez la réplique positive guérie de la réplique négative à la main. 4. Préparer la réplique positive racine de la cellulose éthylique. Pour générer la solution de cellulose d’éthyle, mettre 1,32 ml de ptalate de diéthyle comme plastifiant dans une tasse de 100 ml. Ajouter 20 mL d’éthanol et remuer à RT pendant 2 h. Ajouter 3,3 g de cellulose éthylique et remuer toute la nuit. Pour générer la réplique positive, placez la réplique négative en polyuréthane dans une boîte de Pétri. Verser la solution de cellulose éthylique sur le dessus de la réplique négative. Gardez la boîte de Pétri toute la nuit à RT sous le capot. Retirez le réplica positif de la réplique négative très lentement par forceps.

Representative Results

Pour former la réplication de la microstructure de surface de racine, une racine doit être choisie pour le moulage. Nous cultivons des plants de tomates dans le sol, ce qui rend l’utilisation de la racine naturelle du système racinaire extrêmement difficile. L’enlèvement du sol du système racinaire peut être difficile et en outre, les racines du système racinaire sont fragiles et peuvent se briser lors des tentatives de moulage. Nous suggérons donc d’abord d’utiliser des racines plus rigides, pour établir le protocole en laboratoire. La formation de ces racines est décrite à la figure 1A. Le système racinaire de la plante est enlevé après la culture de la plante pendant 3 semaines et la plante sans racines est placée dans l’eau pendant environ une semaine jusqu’à ce que les racines adventieuses émergent de la tige. Ces racines peuvent être utilisées pour la réplication pendant l’établissement du protocole. Une fois que le protocole a été bien établi, une structure de surface de racine plus réaliste est souhaitée. Ici, nous suggérons d’éviter les racines cultivées dans le sol comme l’enlèvement complet du sol dans extrêmement difficile. Au lieu de cela, nous suggérons l’utilisation de racines germinales, fournissant des informations précieuses sur la microstructure de surface racinaire d’une plante génétiquement spécifique. La croissance de ces racines est décrite à la figure 1B. Les graines sont placées sur un papier filtre humide et incubées à 25 °C. Après environ 5 jours, pendant lesquels le papier filtre est maintenu humide, les racines germées sont assez longues pour la réplication. Ces racines sont plus fragiles que les racines précédemment suggérées et nécessitent des soins plus délicats. La production du réplica de microstructure de surface racine est un processus en deux étapes. Dans la première étape, la racine naturelle est moulée dans un moule à base de polyuréthane (la réplique négative). L’avantage de cette étape est que tous les matériaux pour le moule en polyuréthane sont en cours de préparation et la racine est placée sur le dessus de la solution préparée à la toute fin pour une exposition de 10 min aux UV. En conséquence, le tissu biologique n’est pas exposé à des conditions difficiles pendant trop longtemps et peut être manipulé doucement à la fin du processus. Si toutes les étapes du protocole sont suivies, un bon réplica négatif est généré. Cette réplique affichera la structure cellulaire de la surface de la racine ainsi que les trous représentant l’emplacement des poils racinaires (Figure 2A). Si certaines étapes critiques du protocole ne sont pas suivies, la procédure échouera. Une telle étape est le placement de la racine sur la solution de polyuréthane avant le durcissement. La racine doit être placée très doucement pour éviter la submersion de celui-ci dans la solution en polyuréthane. Une telle immersion, de n’importe quelle partie de la racine, causera le piégeage de la racine dans le polymère dur sans capacité de l’enlever. Si un tel événement se produit, la racine restera dans le réplica négatif après qu’il soit guéri (Figure 2B). Une autre étape cruciale concerne le temps de durcissement par la lumière UV. Le temps de séchage recommandé est de 8\u201210 min. Passer 10 min se traduira par un moule en polyuréthane extrêmement dur, ce qui rend impossible d’enlever la racine sans la casser dans le moule en polyuréthane. La rupture de la racine peut parfois être visible à l’œil nu, par exemple, lorsqu’une grande pièce est cassée (figure 2C, dessus, marqué de flèches violettes). Cependant, parfois de petits morceaux de racine sont laissés dans le matériau qui sont difficiles à repérer à l’œil nu et un microscope doit être utilisé (Figure 2C, en bas, marqué avec des flèches violettes). Nous recommandons d’examiner attentivement la réplique négative de polyuréthane avec un microscope avant la poursuite du protocole pour s’assurer qu’aucune racine résiduelle n’est présente. Une fois que la réplique négative de polyuréthane est préparée ; de nombreux matériaux peuvent être utilisés pour la préparation de la réplique positive. La préparation de la réplique positive, en utilisant la réplique négative en polyuréthane comme un moule, est simple et dépend entièrement de la qualité de la réplique négative polyuréthane. Pour générer le réplica positif, nous avons utilisé à la fois PDMS- comme il est bien connu dans le domaine de la lithographie molle (Figure 3A)- et la cellulose éthylique comme un matériau qui imite mieux les propriétés de la surface de la racine qui est principalement composé de cellulose (Figure 3B). L’image SEM de la réplique PDMS montre les poils racine très clairement. Les poils sont dans la zone d’élongation, où ils commencent à émerger. Par conséquent, la longueur des poils racinaires varie le long de la surface de la racine à mesure qu’ils deviennent plus longs, un peu comme dans la racine naturelle (Figure 3A). La cellulose éthylique génère des pellicules plus dures et moins flexibles que les PDMS. Par conséquent, l’enlèvement de celui-ci du moule négatif nécessite plus de soin. Cependant, certains poils et la microstructure de surface sont visibles sous le microscope léger (figure 3B). Nous avons utilisé ces deux matériaux pour générer la réplique positive, cependant, tout matériel qui peut former un film sera un bon candidat pour la réplique positive, en utilisant la réplique négative polyuréthane. Figure 1 : Racines des plantes de tomates pour la réplication. (A) Une plante de tomate (M82) est cultivée à 25 °C avec 9 h de lumière et 15 h d’obscurité. Après 3 semaines, la plante est retirée du sol et le système racinaire est coupé. La plante sans racines est mise dans l’eau jusqu’à ce que les racines adventieuses émergent de la tige après environ une semaine. Ces racines ne montrent pas la structure exacte comme les racines du système racinaire, mais elles représentent un bon modèle. Ces racines sont moins fragiles que les racines du système racinaire et sont donc préférés travailler avec lors de l’établissement de la technique en laboratoire. (B) Les graines de tomate (M82) sont mises sur un papier filtre humide dans une boîte de Pétri et incubées à 25 °C. Le papier est hydraté tous les jours et les graines germent. Les racines sont de plus en plus et après environ 5 jours sont assez longs pour être utilisés pour la réplication. Ces racines sont plus douces et doivent être utilisées une fois que la méthode est bien établie. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Figure 2 : Images de microscopie de réplique négative en polyuréthane. (A) Image SEM de réplique négative en polyuréthane faite selon un protocole suivant toutes les étapes. La structure cellulaire est clairement visible. Les flèches jaunes pointent vers les trous formés par les poils de la racine. (B) Images de microscopie légère de réplique négative de polyuréthane avec une racine à l’intérieur de celui-ci car il était entièrement couvert avec la solution et l’enlèvement de celui-ci était impossible. Le négatif de polyuréthane a été guéri avec la racine à l’intérieur. La racine est visible par l’œil et à l’aide d’une microscopie légère. Il est impossible d’enlever cette racine de la réplique guérie. (C) Images de microscopie légère de réplique négative en polyuréthane qui a été maintenue sous la lumière UV pendant trop longtemps. En conséquence, la racine ne pouvait pas être entièrement enlevée du polymère avec de grandes particules visibles par l’œil (image supérieure, marquée de flèches violettes) ou de petites fractions visibles uniquement par microscope (image inférieure, marquée de flèches violettes). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Figure 3 : Images au microscope d’une réplique positive. (A) Micrographe SEM d’une réplique positive faite à partir de PDMS. L’agrandissement montre les poils des racines. (B) Images de microscopie légère d’une réplique positive faite à partir de cellulose d’éthyle. Les poils sont représentés dans les images de droite tandis que la texture de surface est visible dans l’image à gauche. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Discussion

Nous présentons une nouvelle méthode pour la réplication de la microstructure de surface de racine. Cette méthode s’appuie sur les méthodes existantes de réplication de la microstructure de surface des feuilles4. Afin de développer cette méthode, nous avons dû modifier la méthode existante pour les feuilles. Nous avons réalisé que l’étape problématique dans la copie de la méthode de réplication des feuilles dans les racines implique la première étape du moulage des racines. C’est la partie la plus sensible de la méthode car elle implique le tissu biologique. En conséquence, nous voulions choisir un polymère qui exigerait des conditions relativement douces pour guérir et donc causer des dommages minimes au tissu biologique. Nous avons choisi le polyuréthane car il peut être polymérisé rapidement (dans les 10 min) sous la lumière UV29. En outre, il est très difficile une fois polymérisé30 et nous espérions que cette propriété permettrait l’enlèvement relativement facile de la racine du moule en polyuréthane.

La méthode présentée est une approche en deux étapes dans laquelle l’image négative (réplique négative) est formée dans la première étape et la réplication est formée dans la deuxième étape, basée sur le réplica négatif. Cela élargit la gamme de matériaux avec lesquel nous pouvons travailler. La réplication de la microstructure de surface de feuille a été principalement exécutée sur pdms ou matériaux époxy11,31. Certains travaux ont été effectués avec d’autres matériaux, en particulier des matériaux soutenant la croissance des micro-organismes13,32. C’est parce que ces dernières années cette méthode a été utilisée pour étudier les interactions micro-organisme-surface dans le contexte de la structure de surface des feuilles. Cependant, aucun matériau semblable à la cellulose n’a été utilisé dans cette méthode dans le contexte des feuilles. Nous suggérons l’utilisation d’une réplique négative en polyuréthane comme un moule et une variété de matériaux pour la réplique positive. En d’autres termes, faire la réplique positive, à partir d’une variété de matériaux, est relativement facile une fois qu’une bonne réplique négative est faite. Nous utilisons actuellement des dérivés de la cellulose, mais nous explorons les possibilités d’utiliser des matériaux plus pertinents à la surface des racines tels que la pectine et la lignine33,34 en combinaison avec des dérivés de cellulose.

La méthode s’étend également sur la méthode existante de réplication de la microstructure de surface des feuilles puisque la feuille est une surface 2D alors que la surface de la racine est incurvée et donc une surface 3D. Notre méthode ne permet pas la réplication de toute la surface puisque l’intégration de la racine entière dans la solution de polyuréthane ne permet pas sa libération. Par conséquent, un côté de la racine doit être choisi lors de la reproduction de la microstructure de surface de racine. La surface synthétique générée est incurvée et représente environ la moitié de la surface, mais pas la totalité. Notre hypothèse est que les caractéristiques structurelles de la surface de la racine sont principalement symétriques sur l’axe le long de la longueur de la racine. Cependant, dans les études où une telle symétrie n’est pas assumée, il faut faire attention à choisir la racine latérale appropriée à reproduire.

Nous présentons deux options pour que les racines soient utilisées comme moules. La première est l’option des racines adventieuses cultivées à partir de la tige et la seconde est l’option des racines germées sur le papier. La première option est principalement destinée à aider les chercheurs à pratiquer la méthode que ces racines sont plus robustes et plus faciles à travailler avec. La deuxième option représente les différences génétiques qui peuvent être trouvées entre les racines des différents cultivars, quelles que soient les conditions environnementales. Ces surfaces peuvent être utilisées comme outils de recherche importants, cependant, il faut être conscient que l’environnement peut avoir une forte influence sur la structure de la surface de la racine, en particulier le sol dans lequel les racines sont cultivées35,36. En raison du stress mécanique infligé par le sol, certains changements morphologiques sont liés à se produire, en plus des blessures qui s’accumulent à la surface que la racine pénètre dans le sol37. L’enlèvement des racines du sol, ainsi que leur nettoyage, sans endommager leur structure est une tâche très difficile. Par conséquent, nous ne sommes pas optimistes quant à la capacité d’utiliser cette méthode pour imiter de manière fiable la microstructure de surface racinaire des racines cultivées dans le sol. Toutefois, pour la recherche axée sur les différences génétiques ou les différences environnementales où le changement de microstructure est sensiblement clair, cette méthode peut être utilisée comme un outil pour étudier l’influence de la microstructure de surface des racines.

Notre méthode produit une surface inerte imitant uniquement les propriétés microstructurales de la surface de la racine. Bien que cette méthode soit conçue pour séparer les effets structurels des interactions entre les racines et l’environnement de tous les autres effets, nous ne pouvons ignorer les composés chimiques présents dans ces interactions. Certains micro-organismes peuvent ne pas survivre ou fonctionner à la surface sans l’ajout de composés, en particulier les nutriments. La prochaine étape dans le développement de cette plate-forme sera l’ajout contrôlé de composés chimiques pour étudier leurs effets sur les différentes interactions lorsqu’ils sont combinés avec la structure.

Cette méthode a été développée comme première étape dans le développement d’une plate-forme synthétique pour étudier les interactions racine-micro-organisme. Ici, nous imitons la microstructure de la surface de la racine et cette plate-forme initiale peut être utilisée pour étudier l’influence de la microstructure de surface sur le comportement des micro-organismes. Cependant, cette plate-forme est limitée car il manque beaucoup d’autres éléments du système naturel. Cette plate-forme devrait être développée avec l’utilisation des matériaux droits pour générer la surface et avec l’ajout d’autres produits chimiques critiques dans le système. Dans une plate-forme plus avancée, nous pouvons également imaginer la distribution spatiale des produits chimiques. Cependant, étant donné qu’il n’existe actuellement aucune autre méthode pour isoler les effets structurels dans les interactions racine-micro-micro-micro-organisme, nous espérons que les chercheurs pourraient utiliser cette plate-forme initiale pour poser des questions spécifiques à la structure dans ces interactions.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

La recherche a été appuyée par des fonds d’amorçage de l’Organisation de recherche agricole à MK.

Materials

2-hydroxy-2-methylpropiophenone Sigma 405655
Diethyl phthalate Across 114520010
Diurethane dimetharylate Sigma 436909
Ethyl cellulose Across 232705000
Ethyl methacrylate Sigma 234893
Shaphir Solution GAT fertilizer 6-2-4
Sylgard 184 kit Polymer-G 510018400500
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References

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Biomimetic ReplicationRoot Surface MicrostructureSoft LithographyRoot-environment InteractionsNegative MoldAdventitious RootsSeed Germinated RootsDiurethane DimethacrylateEthyl MethacrylatePlasticizerPhoto InitiatorPDMS (polydimethylsiloxane)Positive Replica

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Kumari, P., Sayas, T., Kleiman, M. Biomimetic Replication of Root Surface Microstructure using Alteration of Soft Lithography. J. Vis. Exp. (162), e61437, doi:10.3791/61437 (2020).
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