Este protocolo describe un método para cultivar neuronas primarias del hipocampo a partir del cerebro embrionario del ratón. La expresión de la clase I importante del complejo de la histocompatibilidad en la superficie extracelular de neuronas cultivadas entonces es evaluada por análisis cytometric del flujo.
Las pruebas cada vez mayores apoyan la hipótesis que las interacciones neuro-inmunes afectan la función del sistema nervioso en condiciones homeostáticas y patológicas. Una función bien estudiada de la clase I del complejo de histocompatibilidad mayor (MHCI) es la presentación de péptidos derivados de células al sistema inmune adaptativo, particularmente en respuesta a la infección. Más recientemente se ha demostrado que la expresión de moléculas de MHCI en las neuronas puede modular los cambios dependiente de la actividad en la conectividad sináptica durante el desarrollo normal y trastornos neurológicos. La importancia de estas funciones para la salud del cerebro apoya la necesidad de un ensayo sensible que detecta fácilmente la expresión de MHCI en las neuronas. Aquí se describe un método para el cultivo primario de las neuronas murinas del hipocampo y luego la evaluación de la expresión de MHCI por análisis citométrico de flujo. El hipocampo murino se microdiseca de las crías de ratón prenatales en el día embrionario 18. El tejido se disocia en una suspensión unicelular utilizando técnicas enzimáticas y mecánicas, luego se cultiva en un medio libre de suero que limita el crecimiento de células no neuronales. Después de 7 días in vitro, la expresión de MHCI es estimulada tratando las células cultivadas farmacológicamente con interferón beta. Las moléculas de MHCI se etiquetan in situ con un anticuerpo marcado fluorescentemente, luego las células se disocian no enzimáticamente en una suspensión de una sola célula. Para confirmar la identidad neuronal, las células se fijan con paraformacionaldehído, permeabilizadas y etiquetadas con un anticuerpo marcado fluorescentemente que reconoce el antígeno nuclear neuronal NeuN. La expresión de MHCI entonces es cuantificada en neuronas por análisis cytometric del flujo. Las culturas neuronales se pueden manipular fácilmente por modificaciones genéticas o intervenciones farmacológicas para probar hipótesis específicas. Con ligeras modificaciones, estos métodos se pueden utilizar para cultivar otras poblaciones neuronales o para evaluar la expresión de otras proteínas de interés.
El sistema nervioso central (CNS) fue pensado una vez para ser desprovisto de la vigilancia inmune, referida como “privilegiado inmune1.” Ahora está claro que este privilegio no equivale a la ausencia absoluta de componentes inmunes, sino más bien, a una regulación especializada que funciona para limitar el daño asociado a la inmunopatología1. De hecho, la comunicación entre el SNC y el sistema inmunológico es una conversación continua que es necesaria para el desarrollo saludable del cerebro y la respuesta a las infecciones2,3.
Las moléculas principales del complejo de histocompatibilidad clase I (MHCI) son proteínas transmembrana poligénicas y polimórficas más conocidas por su función en la presentación de péptidos antigénicos a las células T CD8+ durante la infección4. Los complejos clásicos de MHCI consisten en una transmembrana α cadena y una cadena ligera extracelular, llamada β2-microglobulina. La cadena α contiene un surco polimórfico que se une a un péptido antigénico para la presentación5. La expresión adecuada de MHCI en la membrana extracelular requiere la acción coordinada de chaperonas moleculares en el retículo endoplásmico para asegurar el plegamiento adecuado de la cadena α y β2-microglobulina junto con la carga de un ligando peptídico de alta afinidad5. Sólo una vez que se ensamblan los complejos MHCI, se exportan del retículo endoplásmico a la membrana plasmática6. Tras el compromiso del receptor cognado de células T con el complejo MHCI cargado de péptidos, las células T CD8+ median la muerte celular liberando gránulos líticos que contienen perforina y granzimas o induciendo apoptosis a través del receptor Fas de unión en la membrana celular diana7. Además, las células TCD8+ producen citoquinas, como el interferón gamma (IFNγ) y el factor de necrosis tumoral alfa (TNFα), que pueden activar mecanismos antivirales en células infectadas sin efectos citopáticos8,9. Para muchos virus neurotrópicos, cd8+ células T son necesarios para eliminar la infección del SNC10,11,12.
Anteriormente se pensaba que las neuronas expresan MHCI sólo en condiciones de daño, infección viral, o con estimulación in vitro de citoquinas. Recientemente, la investigación ha identificado un papel para la expresión neuronal de MHCI en la remodelación sináptica y la plasticidad13,14. Aunque los mecanismos precisos que subyacen a la regulación de la sinapsis no se entienden bien, los datos indican que el nivel de expresión de MHCI está regulado por la actividad sináptica15,16. Una hipótesis postula que las neuronas expresan inmunoglobulina emparejada como el receptor B (PirB) presinápticamente, que se une a MHCI transynaptically13,17. Esta interacción inicia una cascada de señalización por PirB que se opone a las vías implicadas en la remodelación sináptica, reforzando y estabilizando así la conexión sináptica17,18,19. En ausencia de actividad neuronal, la expresión de MHCI disminuye14,y la pérdida de MHCI resulta en la eliminación defectuosa de la sinapsis y circuitos sinápticos mal organizados20,21.
El ensayo descrito aquí, que fue adaptado de Chevalier et al.9,utiliza el análisis citométrico de flujo para evaluar cuantitativamente la expresión de proteínas extracelulares de MHCI en cultivos primarios de neuronas murinas del hipocampo. Este protocolo ilustra las técnicas iniciales para microdissecting el tejido hippocampal de cachorros embrionarios del ratón. A continuación, detalla los procesos para la disociación enzimática y mecánica del tejido en una suspensión unicelular y los métodos para el mantenimiento de los cultivos invitro. Debido a que no se dividen, una vez que están en cultivo, las neuronas deben ser plateadas en un plato y densidad adecuada para su punto final experimental. A continuación, se describen los pasos para inducir la expresión de MHCI con interferón beta (IFNβ), inmunoetiquetado para MHCI y núcleos neuronales marcador NeuN, y el análisis de células por citometría de flujo. Finalmente, se describen los procedimientos para evaluar los datos de citometría de flujo para identificar las neuronas MHCI-positivas y cuantificar el nivel de la expresión de MHCI. También se observan en este protocolo pequeños ajustes que se pueden hacer con el fin de cultivar neuronas corticales además o en lugar de neuronas del hipocampo. Este protocolo se puede modificar fácilmente para probar hipótesis específicas utilizando variaciones genéticas o tratamientos farmacológicos.
Este protocolo describe la disección y la cultura de neuronas hippocampal primarias de cachorros prenatales del ratón en el día embrionario 18. El uso de neuronas primarias cultivadas a partir de roedores es una de las metodologías más fundamentales desarrolladas en la neurobiología moderna22. Aunque las líneas celulares inmortalizadas pueden modelar ciertos aspectos de las neuronas, su naturaleza como células derivadas de tumores, la falta de desarrollo de axones definidos y la división celular continua plantean dudas sobre si recapitulan fielmente las propiedades de las neuronas post-mitóticas in vivo23. Otra alternativa a las neuronas primarias es el uso de células madre pluripotentes inducidas por humanos (HiPSCs). La tecnología para el uso de hiPSCs, especialmente aquellos que son derivados de pacientes, ha avanzado rápidamente en los últimos años24. Sin embargo, todavía existen limitaciones para trabajar con HiPSCs, incluyendo la variabilidad entre líneas celulares, la falta de madurez funcional y las diferencias en los perfiles epigenéticos25. Aunque también hay limitaciones para trabajar con el modelo reduccionista de las neuronas primarias de roedores, las neuronas cultivadas conservan la naturaleza post-mitótica de las neuronas in vivo. Además, las herramientas expansivas de biología molecular y las modificaciones genéticas disponibles para los ratones favorecen el uso de neuronas primarias sobre hiPSCs para muchas aplicaciones, y los estudios en ratones se pueden traducir fácilmente al organismo in vivo más complejo sin perder el sistema genético experimental. Por estas razones, muchos investigadores utilizan neuronas primarias de roedores para verificar aspectos clave, si no la mayor parte, de su investigación.
Para ciertos ensayos, las neuronas se pueden analizar directamente después del aislamiento del cerebro exvivo. Esto es particularmente deseable para experimentos con ratones adultos que pueden ser sometidos a condiciones experimentales específicas o que pueden depender de interacciones de múltiples tipos celulares; sin embargo, hay varias cuestiones que limitan el tipo de análisis que se pueden hacer. Es técnicamente difícil preparar una suspensión unicelular de neuronas de los cerebros de ratones adultos porque las neuronas están interconectadas y ensheadas de forma única por la mielina26. Los métodos no enzimáticos de trituración de tejidos son ineficientes para disociar el tejido y causar la muerte celular, mientras que las preparaciones enzimáticas a menudo escinden los antígenos de la superficie celular27. Además, mientras que la mielina está en gran parte ausente de los ratones embrionarios, comprende alrededor del 20% del cerebro adulto, y puede perjudicar el aislamiento celular viable e impedir el análisis de citometría de flujo28. Muchas de las técnicas que se han desarrollado en última instancia despojar a las neuronas de su citosol y dejar cuerpos celulares pequeños y redondeados que consisten principalmente en núcleos29. Aunque esto es aceptable para algunos análisis, esto no es apropiado para cuantificar la expresión de proteínas citoplasmáticas o extracelulares. Además, el sistema reduccionista de cultivo celular permite probar preguntas mecanicistas específicas en una escala de tiempo más corta de lo que es frecuentemente posible con un sistema in vivo.
También se describen en este protocolo los métodos para estimular la expresión de MHCI farmacológicamente con IFNβ, y la cuantificación de la expresión extracelular de MHCI por citometría de flujo. La estimulación por IFNβ es un control positivo útil para probar otras condiciones experimentales, pero se puede observar que IFNγ y el ácido kainic también pueden estimular la expresión de MHCI en neuronas9,30,mientras que la tetrodotoxina disminuye la expresión de MHCI14. Los métodos anteriores para detectar la expresión de MHCI se basaron en la hibridación in situ y el análisis inmunohistoquímico14,15,20,31. Mientras que los análisis mRNA-basados, tales como hibridación in situ y qRT-PCR, pueden determinar la localización espaciotemporal, la especificidad del tipo de célula, y los niveles de transcripción del gen, estos análisis no pueden evaluar la traducción o el transporte de la proteína a la membrana de plasma. El análisis de Immunohistochemical y de la mancha blanca /negra occidental puede determinar diferencias en la expresión de la proteína y la localización potencialmente celular pero puede ser difícil de cuantificar exactamente. Además, muchos anticuerpos MHCI reconocen la estructura terciaria del complejo, y son altamente sensibles a los cambios conformacionales. Así, las condiciones de permeabilización o desnaturalización dan lugar a la pérdida de inmunorreactividad de MHCI32. El método presentado aquí utiliza immunostaining in situ para MHCI, que permite el reconocimiento de la proteína por el anticuerpo en su conformación nativa, seguido por métodos de la fijación y de la permeabilización.
Con ligeras modificaciones, los métodos descritos aquí se pueden utilizar para cultivar otras poblaciones neuronales o para evaluar la expresión de otras proteínas extracelulares de interés. En este protocolo se observan modificaciones fáciles que se pueden hacer para cultivar neuronas corticales, pero los métodos aquí descritos también pueden ser utilizados para cultivar otras poblaciones neuronales, como las neuronas estriadas33. Además, aunque este protocolo especifique immunostaining de MHCI y de NeuN, otros marcadores celulares se pueden identificar de una manera similar. En general, los marcadores extracelulares pueden ser tratados como MHCI y los marcadores intracelulares pueden ser tratados como NeuN. Sin embargo, cabe señalar que durante el paso de disociación celular, las proyecciones axonales se separan del soma. Debido a que la estrategia de gating definida aquí filtra los desechos celulares y se centra en los núcleos neuronales marcador NeuN, las proteínas que se expresan exclusivamente en proyecciones axonales pueden no ser detectadas.
Hasta hace poco, se pensaba que las neuronas expresaban MHCI sólo en respuesta al daño, la infección o la estimulación in vitro de citoquinas para comprometer las células T CD8+ citotóxicas9. Una nueva investigación ha dilucidado otra función del MHCI en la regulación de las conexiones sinápticas durante el desarrollo13. El protocolo descrito aquí utiliza IFNβ para estimular la expresión de MHCI en neuronas cultivadas de tipo salvaje, pero se pueden utilizar métodos similares con una variedad de estímulos celulares o modificaciones genéticas para probar hipótesis específicas. Este método permitirá a los investigadores investigar los mecanismos moleculares que regulan la expresión de MHCI, lo que mejorará la comprensión del papel dicotómico de MHCI en estas dos funciones celulares distintas.
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue apoyado por NIA R00 AG053412 (KEF).
1.5 ml Microcentrifuge Tubes | Fisher | 05-408-129 | Laboratory Supplies |
100 mm sterile culture dish | Fisher | FB012924 | Tissue Culture Supplies |
15 ml Centrifuge Tubes | Genesee | 21-103 | Laboratory Supplies |
50 ml centrifuge tube | Genesee | 21-108 | Laboratory Supplies |
500 mM EDTA | Invitrogen | AM9260G | FACS Buffer Reagent |
70% Ethanol | Fisher | BP82031Gal | Tissue Culture Supplies |
96 well U-bottom plate | Genesee | 25-221 | Flow Cytometry Supplies |
B27 | Gibco | 17504044 | Neuron Culture Reagent |
Borate Buffer | Thermo Scientific | 28341 | Tissue Culture Supplies |
Borosilicate Glass Pasteur Pipette | Fisher | 13 678 20C | Laboratory Supplies |
Cell Dissociation Buffer | Gibco | 13 151 014 | Flow Cytometry Supplies |
DNase I | Thermo | 90083 | Dissociation Solution Reagent |
dPBS | Gibco | 14190-235 | Tissue Culture Supplies |
Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | Dissection Tool |
Dumont #7 Forceps | Fine Science Tools | 91197-00 | Dissection Tool |
Fetal Bovine Serum | Gibco | 26140079 | Tissue Culture Supplies |
Fine Forceps | Fine Science Tools | 91113-10 | Dissection Tool |
Fine Scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | Dissection Tool |
Fix and Perm Cell Permeabilization Kit | Invitrogen | GAS003 | Flow Cytometry Supplies |
Glutamax | Gibco | 35050061 | Neuron Culture Reagent |
Hibernate-E Medium | Gibco | A1247601 | Neuron Culture Reagent |
Instant Sealing Sterilization Pouches | Fisher | 181254 | Tissue Culture Supplies |
Interferon Beta | PBL Assay Science | 12405-1 | Flow Cytometry Supplies |
Milli-Mark Anti-NeuN-PE Antibody, clone A60 | MilliporeSigma | FCMAB317PE | Flow Cytometry Antibody |
Neurobasal Media | Gibco | 21103049 | Neuron Culture Reagent |
Pacific Blue anti-mouse H-2Kb Antibody | BioLegend | 116513 | Flow Cytometry Antibody |
Papain Solution | Worthington | LS003126 | Dissociation Solution Reagent |
Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714 | Fixative |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | Neuron Culture Reagent |
Poly-D-Lysine | Sigma | P7280 | Neuron Culture Reagent |
Standard Pattern Forceps | Fine Science Tools | 91100-12 | Dissection Tool |
Stereo dissection microscope | Swift | M29TZ-SM99CL-BTW1 | Dissection Tool |
Surgical Scissors | Fine Science Tools | 91401-10 | Dissection Tool |
Transfer Pipets | Corning | 357575 | Laboratory Supplies |
TruStain FcX (anti-mouse CD16/32) Antibody | BioLegend | 101319 | Flow Cytometry Antibody |
Trypan Blue | Sigma | T8154-100ML | Tissue Culture Supplies |