Этот протокол описывает метод культивирования первичных нейронов гиппокампа из эмбрионального мозга мыши. Выражение основных гистосовместимости сложного класса I на внеклеточной поверхности культурных нейронов затем оценивается с помощью цитометрического анализа потока.
Увеличение доказательств подтверждает гипотезу о том, что нейроиммунерные взаимодействия влияют на функцию нервной системы как в гомеостатических, так и в патологических условиях. Хорошо изученной функцией основных гистосовместимости комплексного класса I (MHCI) является представление пептидов, полученных клетками, для адаптивной иммунной системы, особенно в ответ на инфекцию. Совсем недавно было показано, что выражение молекул MHCI на нейронах может модулировать деятельность зависимых изменений в синаптической связи во время нормального развития и неврологических расстройств. Важность этих функций для здоровья мозга поддерживает необходимость чувствительного анализа, который легко обнаруживает выражение MHCI на нейронах. Здесь мы описываем метод первичной культуры нейронов гиппокампа мурина, а затем оценку экспрессии MHCI с помощью цитометрического анализа потока. Гиппокамп Мурина микродисципирован из пренатальных щенков мыши в эмбриональный день 18. Ткань разобщается в одноклеточную подвеску с использованием энзиматических и механических методов, а затем культурируется в безотхвосточном средстве массовой информации, что ограничивает рост не нейрональных клеток. После 7 дней в пробирке, выражение MHCI стимулируется путем лечения культурных клеток фармакологически с бета-интерферона. Молекулы MHCI помечены на месте флуоресцентно помеченными антителами, затем клетки не мезизматически разобщены в одноклеточную подвеску. Чтобы подтвердить нейронную идентичность, клетки фиксируются параформальдегидом, проницаемы и помечены флуоресцентно помеченными антителами, которые распознает нейрональный ядерный антиген NeuN. Выражение MHCI затем количественно на нейроны по потоку цитометрического анализа. Нейронными культурами можно легко манипулировать либо генетическими модификациями, либо фармакологическими вмешательствами для проверки конкретных гипотез. С небольшими изменениями, эти методы могут быть использованы для культуры других популяций нейронов или для оценки выражения других белков, представляющих интерес.
Центральная нервная система (ЦНС) когда-то считалась лишенной иммунного наблюдения, именуемого «иммуннымпривилегированным 1». Теперь ясно, что эта привилегия не приравнивается к абсолютному отсутствию иммунных компонентов, а, скорее, специализированные регулирования, которые функции по ограничению ущерба, связанного симмунопатологией 1. В самом деле, связь между ЦНС и иммунной системы является постоянный разговор, который необходим для здорового развития мозга и ответна инфекции 2,3.
Основные молекулы комплекса гистосовости I (MHCI) являются полигенными и полиморфными трансмембранными белками, наиболее известными своей функцией в представлениях антигенных пептидов CD8и Т-клеток во времяинфекции 4. Классические комплексы MHCI состоят из трансмембрана α цепи и внеклеточной световой цепи, называемой q2-микроглобулин. В α содержит полиморфную канавку, которая связывает антигенный пептид для представления5. Правильное выражение MHCI на внеклеточной мембране требует скоординированного действия молекулярных сопровождающихся в эндоплазмической цитулуме для обеспечения правильного складывания α-цепного и 2-микроглобулина вместе с загрузкой пептидного лигандавысокого сродства 5. Только после сборки комплексов MHCI они экспортируются из эндоплазмической цитулумы в плазменную мембрану6. После взаимодействия рецептора cognate T клеток с пептид-нагруженным комплексом MHCI,CD8 и T клетки опосредуют убийство клетки путем выпускать lytic гранулы содержа перфорин и granzymes или путем индуцировать апоптоз через связывая приемный устройства Fas на мембранеклетки цели 7. Кроме того, CD8и Т-клетки производят цитокины, такие как гамма-интерферон (ИФНЗ) и фактор некроза опухоли альфа (ТНФЗ), которые могут активировать противовирусные механизмы в инфицированных клетках без цитопатическихэффектов 8,9. Для многих нейротропных вирусов,CD8 и Т-клеток, необходимых для очищения инфекции от ЦНС10,11,12.
Ранее считалось, что нейроны выражают MHCI только в условиях повреждения, вирусной инфекции, или с стимуляцией цитокинов in vitro. Недавно исследования выявили роль для нейронального выражения MHCI в синаптической реконструкции ипластичности 13,14. Хотя точные механизмы, лежащие в основе регулирования синапса, не очень хорошо изучены, данные указывают на то, что уровень экспрессии MHCI регулируетсясинаптической активностью 15,16. Одна из гипотез утверждает, что нейроны выражают парный иммуноглобулин-как рецептор B (PirB) пресинаптически, который связывает MHCI трансинаптически13,17. Это взаимодействие инициирует сигнальный каскад PirB, который противостоит путям, участвующим в синаптической реконструкции, тем самым укрепляя и стабиливсинаптической связи 17,18,19. При отсутствии нейронной активности экспрессия MHCIснижается на 14,а потеря MHCI приводит к неполноценной ликвидации синапса и неправильной синаптическойсхеме 20,21.
Анализ, описанный здесь, который был адаптирован из Шевалье и др.9, использует поток цитометрического анализа для количественной оценки внеклеточного экспрессии белка MHCI на первичных культурах нейронов гиппокампа мурина. Этот протокол иллюстрирует первоначальные методы микродиссекции ткани гиппокампа от эмбриональных щенков мыши. Затем в нем подробно процессы для энзиматической и механической диссоциации тканей в одноклеточную подвеску и методы поддержания культур впробирке. Потому что они не делят, как только они находятся в культуре, нейроны должны быть помыты в тарелке и плотности подходит для их экспериментальной конечной точки. Далее в нем излагаются шаги по индуцированию экспрессии MHCI с помощью бета-интерферона (ИФНЗ), иммунолабеля для MHCI и маркера нейронных ядер NeuN, а также анализ клеток с помощью цитометрии потока. Наконец, в нем описаны процедуры оценки цитометрии потока для идентификации MHCI-положительных нейронов и количественной оценки уровня экспрессии MHCI. Также отмечены в этом протоколе небольшие корректировки, которые могут быть сделаны для того, чтобы культура корковых нейронов в дополнение к или вместо гиппокампа нейронов. Этот протокол может быть легко изменен для проверки конкретных гипотез с использованием генетических вариаций или фармакологических методов лечения.
Этот протокол описывает вскрытие и культуру первичных гиппокампа нейронов от пренатальных щенков мыши в эмбриональный день 18. Использование первичных нейронов, выуфрапаемых у грызунов, является одним из наиболее фундаментальных методологий, разработанных в современнойнейробиологии 22. Хотя увековеченные клеточные линии могут моделировать определенные аспекты нейронов, их природа как опухолевые клетки, неспособность разработать определенные аксоны, и продолжающееся деление клеток вызывает сомнения в том, что они точно подысовывляют свойства постмитотических нейронов in vivo23. Другой альтернативой первичным нейронам является использование индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток (HiPSCs). Технология использования HiPSCs, особенно те, которые являются пациентом полученных, быстро продвинулась в последние годы24. Тем не менее, есть еще ограничения для работы с HiPSCs в том числе изменчивость между линиями клеток, отсутствие функциональной зрелости, и различия в эпигенетическихпрофилей 25. Хотя существуют также ограничения на работу с демоционистской моделью первичных нейронов грызунов, культурные нейроны сохраняют постмитотическую природу нейронов in vivo. Кроме того, экспансивные инструменты молекулярной биологии и генетические модификации, доступные для мышей, благоприятствуют использованию первичных нейронов над HiPSCs для многих применений, и исследования мышей могут быть легко переведены на более сложный организм in vivo, не теряя экспериментальной генетической системы. По этим причинам, многие исследователи используют первичные нейроны грызунов для проверки ключевых аспектов, если не основная часть, их исследований.
Для некоторых анализов, нейроны могут быть проанализированы непосредственно после изоляции от мозга ex vivo. Это особенно желательно для экспериментов с участием взрослых мышей, которые могут подвергаться определенным экспериментальным условиям или которые могут зависеть от взаимодействия нескольких типов клеток; однако существует ряд вопросов, которые ограничивают тип анализов, которые могут быть сделаны. Это технически сложно подготовить одноклеточную подвеску нейронов из мозга взрослых мышей, потому что нейроны однозначно взаимосвязаны и оболочки миелина26. Неизиматические методы тритурации тканей неэффективны при диссоциации тканей и вызывают гибель клеток, в то время как энзиматические препараты часто расщепляют поверхностныеантигены клеток 27. Кроме того, в то время как миелин в значительной степени отсутствует у эмбриональных мышей, он составляет около 20% взрослого мозга, и может ухудшить жизнеспособную изоляцию клеток и препятствовать анализуцитометрии потока 28. Многие из методов, которые были разработаны в конечном итоге полосы нейронов их цитозола и оставить небольшие, округлые тела клеток, которые состоят в основном изядер 29. Хотя это приемлемо для некоторых анализов, это не подходит для количественной оценки цитоплазмической или внеклеточной экспрессии белка. Кроме того, система культуры клеток-двойственных клеток позволяет тестировать конкретные механистические вопросы в более коротком масштабе времени, чем это часто возможно с системой in vivo.
В этом протоколе также описаны методы стимулирования фармакологическиго выражения MHCI с помощью ИФНЗ, а также количественная оценка внеклеточного выражения MHCI по цитометрии потока. Стимулирование СФНЗ является полезным положительным контролем для тестирования других экспериментальных условий, но можно отметить, что ИФНЗ и кайновая кислота также могут стимулировать выражение MHCIв нейронах 9,30, в то время как тетродотоксин уменьшает выражение MHCI14. Предыдущие методы обнаружения выражения MHCI опирались на гибридизацию на месте и иммуногистохимический анализ14,15,20,31. В то время как анализы на основе мРНК, такие как гибридизация на месте и qRT-PCR, могут определить патиотемпоральную локализацию, специфичность типа клеток и уровни транскрипции генов, эти анализы не могут оценить перевод белка или транспортировку к плазменной мембране. Иммуногистохимический и западный анализ помарки может определить различия в экспрессии белка и потенциально клеточной локализации, но может быть трудно точно количественно. Кроме того, многие антитела MHCI распознают третичную структуру комплекса и очень чувствительны к конформативным изменениям. Таким образом, проницаемость или денатурации условия приводят к потере иммунореактивности MHCI32. Представленный здесь метод использует иммуностимунизацию на месте для MHCI, что позволяет распознавание белка антителом в его родной конформации, а затем методы фиксации и пермеабилизации.
С небольшими изменениями, методы, описанные здесь могут быть использованы для культуры других популяций нейронов или для оценки выражения других внеклеточных белков, представляющих интерес. В этом протоколе отмечены простые изменения, которые могут быть сделаны для того, чтобы культура корковых нейронов, но методы, описанные здесь также могут быть использованы для культуры других нейронных популяций, таких как стриатальные нейроны33. Кроме того, хотя этот протокол определяет иммуностимунирование MHCI и NeuN, другие клеточные маркеры могут быть определены аналогичным образом. В целом, внеклеточные маркеры можно рассматривать как MHCI и внутриклеточные маркеры можно рассматривать как NeuN. Однако следует отметить, что во время клеточной диссоциации от сомы отодряются аксональные проекции. Поскольку стратегия гэтинга, определенная здесь, отсеив клеточный мусор и фокусируется на маркере ядер нейронов NeuN, белки, которые выражаются исключительно в аксональных проекциях, могут не быть обнаружены.
До недавнего времени считалось, что нейроны выражают MHCI только в ответ на повреждение, инфекцию или стимуляцию цитокинов in vitro, чтобы задействовать цитотоксические CD8и Т-клетки 9. Новое исследование прояснит другую функцию MHCI в регулировании синаптических связей во время разработки13. Описанный здесь протокол использует IFN для стимулирования экспрессии MHCI в культурных нейронах wildtype, но аналогичные методы могут быть использованы с различными клеточными стимулами или генетическими модификациями для проверки конкретных гипотез. Этот метод позволит исследователям исследовать молекулярные механизмы, которые регулируют выражение MHCI, что улучшит понимание дихотомиозной роли MHCI на этих двух различных клеточных функций.
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана NIA R00 AG053412 (KEF).
1.5 ml Microcentrifuge Tubes | Fisher | 05-408-129 | Laboratory Supplies |
100 mm sterile culture dish | Fisher | FB012924 | Tissue Culture Supplies |
15 ml Centrifuge Tubes | Genesee | 21-103 | Laboratory Supplies |
50 ml centrifuge tube | Genesee | 21-108 | Laboratory Supplies |
500 mM EDTA | Invitrogen | AM9260G | FACS Buffer Reagent |
70% Ethanol | Fisher | BP82031Gal | Tissue Culture Supplies |
96 well U-bottom plate | Genesee | 25-221 | Flow Cytometry Supplies |
B27 | Gibco | 17504044 | Neuron Culture Reagent |
Borate Buffer | Thermo Scientific | 28341 | Tissue Culture Supplies |
Borosilicate Glass Pasteur Pipette | Fisher | 13 678 20C | Laboratory Supplies |
Cell Dissociation Buffer | Gibco | 13 151 014 | Flow Cytometry Supplies |
DNase I | Thermo | 90083 | Dissociation Solution Reagent |
dPBS | Gibco | 14190-235 | Tissue Culture Supplies |
Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | Dissection Tool |
Dumont #7 Forceps | Fine Science Tools | 91197-00 | Dissection Tool |
Fetal Bovine Serum | Gibco | 26140079 | Tissue Culture Supplies |
Fine Forceps | Fine Science Tools | 91113-10 | Dissection Tool |
Fine Scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | Dissection Tool |
Fix and Perm Cell Permeabilization Kit | Invitrogen | GAS003 | Flow Cytometry Supplies |
Glutamax | Gibco | 35050061 | Neuron Culture Reagent |
Hibernate-E Medium | Gibco | A1247601 | Neuron Culture Reagent |
Instant Sealing Sterilization Pouches | Fisher | 181254 | Tissue Culture Supplies |
Interferon Beta | PBL Assay Science | 12405-1 | Flow Cytometry Supplies |
Milli-Mark Anti-NeuN-PE Antibody, clone A60 | MilliporeSigma | FCMAB317PE | Flow Cytometry Antibody |
Neurobasal Media | Gibco | 21103049 | Neuron Culture Reagent |
Pacific Blue anti-mouse H-2Kb Antibody | BioLegend | 116513 | Flow Cytometry Antibody |
Papain Solution | Worthington | LS003126 | Dissociation Solution Reagent |
Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714 | Fixative |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | Neuron Culture Reagent |
Poly-D-Lysine | Sigma | P7280 | Neuron Culture Reagent |
Standard Pattern Forceps | Fine Science Tools | 91100-12 | Dissection Tool |
Stereo dissection microscope | Swift | M29TZ-SM99CL-BTW1 | Dissection Tool |
Surgical Scissors | Fine Science Tools | 91401-10 | Dissection Tool |
Transfer Pipets | Corning | 357575 | Laboratory Supplies |
TruStain FcX (anti-mouse CD16/32) Antibody | BioLegend | 101319 | Flow Cytometry Antibody |
Trypan Blue | Sigma | T8154-100ML | Tissue Culture Supplies |