Este protocolo descreve um método para a criação de neurônios hipocampais primários do cérebro de camundongos embrionários. A expressão do maior complexo de histocompatibilidade classe I na superfície extracelular dos neurônios cultivados é então avaliada pela análise citométrica de fluxo.
O aumento das evidências sustenta a hipótese de que as interações neuroilógicas impactam a função do sistema nervoso em condições homeostáticas e patológicas. Uma função bem estudada do complexo de histocompatibilidade principal classe I (MHCI) é a apresentação de peptídeos derivados de células ao sistema imunológico adaptativo, particularmente em resposta à infecção. Mais recentemente, foi demonstrado que a expressão de moléculas de MHCI em neurônios pode modular mudanças dependentes da atividade na conectividade sináptica durante o desenvolvimento normal e distúrbios neurológicos. A importância dessas funções para a saúde cerebral sustenta a necessidade de um ensaio sensível que detecte prontamente a expressão MHCI nos neurônios. Aqui descrevemos um método para a cultura primária dos neurônios hipocampais murinos e, em seguida, a avaliação da expressão MHCI por análise citométrica de fluxo. O hipocampo murino é microdissectado de filhotes de camundongos pré-natais no dia 18. O tecido é dissociado em uma única suspensão celular usando técnicas enzimáticas e mecânicas, então cultivadas em uma mídia livre de soro que limita o crescimento de células não neuronais. Após 7 dias in vitro, a expressão MHCI é estimulada pelo tratamento de células cultivadas farmacologicamente com beta interferon. As moléculas de MHCI são rotuladas in situ com um anticorpo fluorescente marcado, em seguida, as células são não enzimaticamente dissociadas em uma única suspensão celular. Para confirmar a identidade neuronal, as células são fixadas com paraformaldeído, permeabilizado e rotulado com um anticorpo fluorescente marcado que reconhece o antígeno nuclear neuronal NeuN. A expressão MHCI é então quantificada em neurônios por análise citométrica de fluxo. Culturas neuronais podem ser facilmente manipuladas por modificações genéticas ou intervenções farmacológicas para testar hipóteses específicas. Com pequenas modificações, esses métodos podem ser usados para cultivar outras populações neuronais ou para avaliar a expressão de outras proteínas de interesse.
O sistema nervoso central (SNC) já foi considerado desprovido de vigilância imunológica, chamado de “imuno privilegiado1“. Agora está claro que esse privilégio não equivale à ausência absoluta de componentes imunológicos, mas sim, uma regulação especializada que funciona para limitar os danos associados à imunopatologia1. De fato, a comunicação entre o SNC e o sistema imunológico é uma conversa contínua que é necessária para o desenvolvimento saudável do cérebro e resposta às infecções2,3.
As principais moléculas de complexo de histocompatibilidade classe I (MHCI) são proteínas transmembranas poligênicas e polimórficas mais conhecidas por sua função na apresentação de peptídeos antigênicos às células CD8+ T durante a infecção4. Os complexos clássicos de MHCI consistem em uma cadeia de α transmembrana e uma cadeia de luz extracelular, chamada β2-microglobulina. A cadeia de α contém um sulco polimórfico que une um peptídeo antigênico para apresentação5. A expressão adequada do MHCI na membrana extracelular requer ação coordenada de acompanhantes moleculares no retículo endoplasmático para garantir a dobra adequada da cadeia de α e β2-microglobulina, juntamente com o carregamento de um ligante de peptídeo de alta afinidade5. Somente uma vez montados os complexos MHCI, eles são exportados do ânticulo endoplasmático para a membrana plasmática6. Após o engajamento do receptor de células T cognato com o complexo MHCI carregado de peptídeo, as células CD8+ T mediam a matança celular liberando grânulos líticos contendo perforina e granzymes ou induzindo apoptose através do receptor Fas de ligação na membrana celular alvo7. Além disso, as células CD8+ T produzem citocinas, como o interferon gama (IFNγ) e o fator de necrose tumoral alfa (TNFα), que podem ativar mecanismos antivirais em células infectadas sem efeitos citópicos8,9. Para muitos vírus neurotrópicos, as células CD8+ T são necessárias para limpar a infecção do CNS10,11,12.
Pensava-se anteriormente que os neurônios expressam MHCI apenas sob condições de dano, infecção viral ou com estimulação de citocina in vitro. Recentemente, pesquisas identificaram um papel para a expressão neuronal do MHCI na remodelagem sináptica e plasticidade13,14. Embora os mecanismos precisos subjacentes à regulação da sinapse não sejam bem compreendidos, os dados indicam que o nível de expressão do MHCI é regulado pela atividade sináptica15,16. Uma hipótese afirma que os neurônios expressam receptor b (PirB) em pares de imunoglobulina, que liga o MHCI transynapticamente13,17. Essa interação inicia uma cascata de sinalização da PirB que se opõe a caminhos envolvidos na remodelação sináptica, reforçando e estabilizando assim a conexão sináptica17,18,19. Na ausência de atividade neuronal, a expressão MHCI diminui14, e a perda de MHCI resulta em eliminação de sinapse defeituosa e circuitos sinápticos desorganizados20,21.
O ensaio aqui descrito, que foi adaptado de Chevalier et al.9,utiliza análise citométrica de fluxo para avaliar quantitativamente a expressão proteica extracelular do MHCI nas culturas primárias dos neurônios hipocampais murine. Este protocolo ilustra as técnicas iniciais para microdisstar tecido hipocampal de filhotes de camundongos embrionários. Em seguida, detalha processos para dissociação enzimática e mecânica do tecido em uma única suspensão celular e métodos para manter as culturas in vitro. Como eles não se dividem, uma vez que estão na cultura, os neurônios devem ser banhados em um prato e densidade adequado para o seu ponto final experimental. Em seguida, ele descreve etapas para induzir a expressão MHCI com interferon beta (IFNβ), imunolabeling para MHCI e marcador de núcleos neuronais NeuN, e analisar células por citometria de fluxo. Por fim, descreve procedimentos para avaliar os dados de citometria de fluxo para identificar neurônios soropositivos e quantificar o nível da expressão MHCI. Também são observados neste protocolo pequenos ajustes que podem ser feitos para cultivar neurônios corticais, além ou em vez de neurônios hipocampais. Este protocolo pode ser facilmente modificado para testar hipóteses específicas usando variações genéticas ou tratamentos farmacológicos.
Este protocolo descreve a dissecção e cultura dos neurônios hipocampais primários de filhotes de camundongos pré-natais no dia 18. O uso de neurônios primários cultivados a partir de roedores é uma das metodologias mais fundamentais desenvolvidas na neurobiologia moderna22. Embora as linhas celulares imortalizadas possam modelar certos aspectos dos neurônios, sua natureza como células derivadas do tumor, falha no desenvolvimento de axônios definidos e a divisão celular contínua levanta dúvidas se eles recapitulam fielmente propriedades de neurônios pós-místicos in vivo23. Outra alternativa aos neurônios primários é o uso de células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem (HiPSCs). A tecnologia para o uso de HiPSCs, especialmente aqueles derivados do paciente, avançou rapidamente nos últimos anos24. No entanto, ainda há limitações para trabalhar com HiPSCs, incluindo variabilidade entre linhas celulares, falta de maturidade funcional e diferenças nos perfis epigenéticos25. Embora também existam limitações para trabalhar com o modelo reducionista dos neurônios primários de roedores, os neurônios cultivados retêm a natureza pós-mitótica dos neurônios in vivo. Além disso, as extensas ferramentas de biologia molecular e modificações genéticas disponíveis para camundongos favorecem o uso de neurônios primários sobre HiPSCs para muitas aplicações, e estudos de camundongos podem ser facilmente traduzidos para o organismo in vivo mais complexo sem perder o sistema genético experimental. Por essas razões, muitos pesquisadores usam neurônios de roedores primários para verificar aspectos-chave, se não a maior parte, de suas pesquisas.
Para certos ensaios, os neurônios podem ser analisados diretamente após o isolamento do ex vivo cerebral. Isso é particularmente desejável para experimentos envolvendo camundongos adultos que podem ser submetidos a condições experimentais específicas ou que podem depender de interações de múltiplos tipos de células; no entanto, existem várias questões que limitam o tipo de análises que podem ser feitas. É tecnicamente desafiador preparar uma única suspensão celular de neurônios do cérebro de camundongos adultos porque os neurônios são exclusivamente interconectados e envoltos pelamielina 26. Métodos não enzimáticos de trituração tecidual são ineficientes em dissociar o tecido e causar morte celular, enquanto preparações enzimáticas muitas vezes cortam antígenos da superfíciecelular 27. Além disso, enquanto a mielina está em grande parte ausente de camundongos embrionários, ela compreende cerca de 20% do cérebro adulto, podendo prejudicar o isolamento celular viável e impedir a análise de citometria de fluxo28. Muitas das técnicas que foram desenvolvidas, em última análise, tiram neurônios de seu citosol e deixam corpos celulares pequenos e arredondados que consistem principalmente em núcleos29. Embora isso seja aceitável para algumas análises, isso não é apropriado para quantificar a expressão de proteína citoplasmática ou extracelular. Além disso, o sistema de cultura celular reducionista permite testar questões mecanicistas específicas em uma escala de tempo mais curta do que é frequentemente possível com um sistema in vivo.
Também descritos neste protocolo estão métodos para estimular a expressão MHCI farmacologicamente com IFNβ, e a quantificação da expressão MHCI extracelular por citometria de fluxo. A estimulação por IFNβ é um controle positivo útil para testar outras condições experimentais, mas pode-se notar que ifnγ e ácido kainic também podem estimular a expressão MHCI nos neurônios9,30, enquanto a tetrodotoxina diminui a expressão MHCI14. Métodos anteriores para detecção da expressão MHCI contaram com hibridização in situ e análise imunohistoquímica14,15,20,31. Embora ensaios baseados em mRNA, como hibridização in situ e qRT-PCR, possam determinar a localização espostetorial, especificidade do tipo celular e níveis de transcrição genética, esses ensaios não podem avaliar a tradução ou o transporte de proteínas para a membrana plasmática. A análise imunohistoquímica e ocidental pode determinar diferenças na expressão proteica e na localização potencialmente celular, mas pode ser difícil quantificar com precisão. Além disso, muitos anticorpos MHCI reconhecem a estrutura terciária do complexo, e são altamente sensíveis às alterações conformais. Assim, as condições de permeabilização ou desnaturação resultam na perda da imunoreatividade MHCI32. O método aqui apresentado utiliza imunostaining in situ para MHCI, que permite o reconhecimento da proteína pelo anticorpo em sua conformação nativa, seguido por métodos de fixação e permeabilização.
Com pequenas modificações, os métodos aqui descritos podem ser usados para cultivar outras populações neuronais ou para avaliar a expressão de outras proteínas extracelulares de interesse. Observados neste protocolo são modificações fáceis que podem ser feitas para cultivar neurônios corticais, mas os métodos descritos aqui também podem ser usados para cultivar outras populações neuronais, como os neurôniosestriais 33. Além disso, embora este protocolo especigue a imunostenção de MHCI e NeuN, outros marcadores celulares podem ser identificados de forma semelhante. Em geral, marcadores extracelulares podem ser tratados como MHCI e marcadores intracelulares podem ser tratados como NeuN. No entanto, deve-se notar que durante a etapa de dissociação celular, as projeções axonais são cortadas da soma. Como a estratégia de gating definida aqui examina detritos celulares e se concentra no marcador de núcleos neuronais NeuN, proteínas que são expressas exclusivamente em projeções axonais podem não ser detectadas.
Até recentemente, pensava-se que os neurônios expressavam MHCI apenas em resposta a danos, infecções ou estimulação de citocina in vitro, a fim de engajar células CD8+ T citotóxias9. Novas pesquisas elucidaram outra função do MHCI na regulação de conexões sinápticas durante o desenvolvimento13. O protocolo descrito aqui usa IFNβ para estimular a expressão MHCI em neurônios cultivados pelo tipo selvagem, mas métodos semelhantes podem ser usados com uma variedade de estímulos celulares ou modificações genéticas para testar hipóteses específicas. Este método permitirá aos pesquisadores investigar os mecanismos moleculares que regulam a expressão do MHCI, o que melhorará a compreensão do papel dicotos do MHCI nessas duas funções celulares distintas.
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi apoiado pela NIA R00 AG053412 (KEF).
1.5 ml Microcentrifuge Tubes | Fisher | 05-408-129 | Laboratory Supplies |
100 mm sterile culture dish | Fisher | FB012924 | Tissue Culture Supplies |
15 ml Centrifuge Tubes | Genesee | 21-103 | Laboratory Supplies |
50 ml centrifuge tube | Genesee | 21-108 | Laboratory Supplies |
500 mM EDTA | Invitrogen | AM9260G | FACS Buffer Reagent |
70% Ethanol | Fisher | BP82031Gal | Tissue Culture Supplies |
96 well U-bottom plate | Genesee | 25-221 | Flow Cytometry Supplies |
B27 | Gibco | 17504044 | Neuron Culture Reagent |
Borate Buffer | Thermo Scientific | 28341 | Tissue Culture Supplies |
Borosilicate Glass Pasteur Pipette | Fisher | 13 678 20C | Laboratory Supplies |
Cell Dissociation Buffer | Gibco | 13 151 014 | Flow Cytometry Supplies |
DNase I | Thermo | 90083 | Dissociation Solution Reagent |
dPBS | Gibco | 14190-235 | Tissue Culture Supplies |
Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | Dissection Tool |
Dumont #7 Forceps | Fine Science Tools | 91197-00 | Dissection Tool |
Fetal Bovine Serum | Gibco | 26140079 | Tissue Culture Supplies |
Fine Forceps | Fine Science Tools | 91113-10 | Dissection Tool |
Fine Scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | Dissection Tool |
Fix and Perm Cell Permeabilization Kit | Invitrogen | GAS003 | Flow Cytometry Supplies |
Glutamax | Gibco | 35050061 | Neuron Culture Reagent |
Hibernate-E Medium | Gibco | A1247601 | Neuron Culture Reagent |
Instant Sealing Sterilization Pouches | Fisher | 181254 | Tissue Culture Supplies |
Interferon Beta | PBL Assay Science | 12405-1 | Flow Cytometry Supplies |
Milli-Mark Anti-NeuN-PE Antibody, clone A60 | MilliporeSigma | FCMAB317PE | Flow Cytometry Antibody |
Neurobasal Media | Gibco | 21103049 | Neuron Culture Reagent |
Pacific Blue anti-mouse H-2Kb Antibody | BioLegend | 116513 | Flow Cytometry Antibody |
Papain Solution | Worthington | LS003126 | Dissociation Solution Reagent |
Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714 | Fixative |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | Neuron Culture Reagent |
Poly-D-Lysine | Sigma | P7280 | Neuron Culture Reagent |
Standard Pattern Forceps | Fine Science Tools | 91100-12 | Dissection Tool |
Stereo dissection microscope | Swift | M29TZ-SM99CL-BTW1 | Dissection Tool |
Surgical Scissors | Fine Science Tools | 91401-10 | Dissection Tool |
Transfer Pipets | Corning | 357575 | Laboratory Supplies |
TruStain FcX (anti-mouse CD16/32) Antibody | BioLegend | 101319 | Flow Cytometry Antibody |
Trypan Blue | Sigma | T8154-100ML | Tissue Culture Supplies |