הערכת הביטוי של קומפלקס היסטו-תאימות גדול מחלקה I על נוירונים היפוקמפוס מורין ראשי על ידי Cytometry זרימה

כל ההליכים בוצעו בהתאם להמלצות במדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה של המכונים הלאומיים לבריאות ובהתאם לעקרונות המנחים הבינלאומיים למחקר ביו-רפואי הכוללים בעלי חיים. הפרוטוקול אושר על ידי אוניברסיטת צפון קרוליינה בוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים בשארלוט (פרוטוקול #19-020). 1. הכנה לתרבות הערה: נהלים אלה צריכים להיעשות בתנאים סטריליים בארון biosafety ייעודי לתרבות הרקמות. ראה טבלה 1 לקבלת מדיה ופתרונות. לעקר את כל כלי הניתוח על ידי autoclaving בשקיות עיקור עצמי. הכינו מלאי עובד של פולי-די-לידין לטיפול במנות תרבות של 12 בארות. להמיס פולי-D-ליצין ב 1x בוראט חוצץ לריכוז של 100 מיקרוגרם / מ”ל (מרוכז 10x). לאחסן כ 1 מ”ל aliquots ב -20 מעלות צלזיוס עד הצורך. לדלל 10x מרוכז פולי-D-ליסין ב dPBS ל 10 מיקרוגרם / מ”ל (1x) ומסנן לעקר. לטפל צלחות תרבות 12-well עם 0.5 מ”ל לכל באר של 1x פולי-D-לידין בטמפרטורת החדר לפחות 1 שעה או לילה לשימוש למחרת. ודא שנפח הפולי-די-לידין מספיק כדי לכסות באופן מלא את החלק התחתון של אזור התרבות. רגע לפני השימוש, יש להסיר פולי-די-ליסין מלוח התרבות, לשטוף פי 3 במים סטריליים ולשמור במים סטריליים עד שהם מוכנים לצלחת. הסר את כל העקבות של נוזל על ידי שאיפה יסודית לפני ציפוי תאים. הכן מדיה צמיחה נוירון ומאגר FACS. מסננים מעוקרים ומאחסנים ב-4°C עד לשימוש. נוירון צמיחה מדיה ניתן לשמור על כ 2 wks; ניתן לשמור מאגר FACS למשך כ- 4 wks. 2. ניתוח היפוקמפוס עוברי הערה: הליך זה יכול להתבצע על הספסל כפי שהוא דורש שימוש במיקרוסקופ סטריאו להסרת קרום ומיקרו-דיסקציה של ההיפוקמפוס. לדבוק בטכניקה אספטית קפדנית כדי למזער את הזיהום הפוטנציאלי. המתת חסד עכבר נקבה C57BL/6J מתוזמן בהריון ביום העוברי 18 בתא CO2. לרסס את עור הבטן ואת הפרווה עם 70% EtOH, ואז לצבוט את העור עם מלקחיים רקמה ולעשות חתך קטן עם מספריים כירורגיים. להסית את הצפק כדי לחשוף את הקרביים והרחם. לתפוס את הרחם עם מלקחיים דפוס סטנדרטי, להרים מתוך החלל, לחתוך את החיבור mesometrium עם מספריים בסדר. מעבירים את הרחם עם עוברים לתרבית פלסטיק סטרילית 100 מ”מ המונחת על קרח. בעזרת מספריים עדינות ומלקחיים עדינים, חותכים בזהירות את הרחם ומסירים את השק העוברי כדי לשחרר עוברים. מעבירים עוברים לתבשיל חדש של תרבית פלסטיק סטרילית 100 מ”מ המכיל dPBS המונח על קרח. ערפו את ראשם של גורים עובריים באמצעות מספריים דקים, והעבירו ראשים לתבנית חדשה של 100 מ”מ בתרבית פלסטיק סטרילית המכילה מדיום Hibernate-E המונח על קרח. כדי להסיר את המוח, להחזיק את הראש עם זוג מלקחיים בסדר ביד אחת. באמצעות מלקחיים #7 מעוקלים של Dumont ביד השנייה, הכנס את קצה המלקחיים בבסיס הגולגולת וצבוט את העצם ואת העור overlying נע במהירות לאורך קו האמצע מבלי לנקב את המוח. שימוש במלקחיים מעוגלים מפרק את העור והגולגולת כדי לחשוף את המוח. לטאטא את המלקחיים המעוקלים מתחת למוח מנורת הריח החשופה למוח הקטן כדי להרים את המוח מהגולגולת. מעבירים את המוח לתבשיל חדש של 100 מ”מ בתרבית פלסטיק סטרילית המכילה מדיום Hibernate-E המונח על קרח. חזור על הפעולה עבור כל מוח.הערה: ניתן לאסוף את כל המוחות בצלחת תרבות אחת, אלא אם כן יש צורך להפריד למטרות ספציפיות לניסוי. תחת מיקרוסקופ ניתוח סטריאו, עובד עם מוח אחד בכל פעם ושני זוגות של מלקחיים #5 דומונט סטריליים, לצבוט את נורות הריח ולהרחיק קרום המוח. הסרה יסודית של קרום המוח יש צורך למנוע זיהום תרבות על ידי תאים אחרים כדי לאפשר ניתוח נוסף. לאחר קרום המוח מוסרים כראוי, הצד העליון של קליפת המוח נפתח לרוחב, אשר יחשוף את ההיפוקמפוס. באמצעות מלקחיים #5 Dumont, לצבוט את ההיפוקמפוס הרחק קליפת המוח המצורפת, ולהעביר בזהירות היפוקמפוס מבודד לצינור חרוט סטרילי 15 מ”ל המכיל 5 מ”ל של מדיום Hibernate-E על קרח. חזור על הניתוח עבור שתי ההמיספרות במוח עבור כל גור עכבר עוברי ולשלב את כל ההיפוקמפי לתוך צינור חרוט אחד 15 מ”ל, אלא אם כן יש צורך בנפרד למטרות ספציפיות לניסוי. לנוירונים קליפתיים תרבותיים, קליפת המוח עשויה להיות מופרדת מתת-קליפת המוח ומעובדת באופן זהה לנוירונים בהיפוקמפוס.הערה: בשלב זה, ניתן להשהות את הפרוטוקול. אחסן מוחות או היפוקמפי מנותח במדיום Hibernate-E בתוספת B27 (2%) ב 4 °C (69 °F) עד חודש אחד, אם כי עיכוב ממושך עלול לסכן את מספר התאים קיימא. 3. ניתוק ופולחן נוירונים בהיפוקמפוס הערה: כל ההליכים צריכים להתבצע בתנאים סטריליים בארון biosafety ייעודי לתרבות רקמות. הכן 0.5 מ”ל של פתרון דיסוציאציה פפאין לכל עובר לניתוק ההיפוקמפוס. נפח פתרון הדיסוציאציה הדרוש ישתנה בהתאם למספר המוחות העובריים המנותחים.הערה: לתרבות הנוירונים בקליפת המוח, הכינו 1.0 מ”ל של תמיסת פפאין לעובר. להמיס 20 μL של השעיית פפאין לכל 1 מ”ל של מדיום E תרדמה על ידי מערבולת במשך כ 3 דקות. לאחר פפאין מומס, להוסיף 1 μL של DNase אני לכל 1 מ”ל של הפתרון. אל מערבולת הפתרון לאחר DNase אני נוסף כמו זה יכול להשבית את האנזים. צינור חרוט צנטריפוגה 15 מ”ל המכיל רקמת היפוקמפוס (שלב 2.10) ב 1, 000 x g במשך 5 דקות. הסר את supernatant ולהוסיף פתרון פפאין. Resuspend את הרקמה על ידי היפוך מספר פעמים. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות, היפוך כדי resuspend הרקמה כל 10 דקות. אם אתם מטפחים נוירונים קליפתיים, העבירו את כל קליפות המוח לתבשיל תרבות סטרילי חדש של 100 מ”מ, שאפתו בזהירות מדיה מהצלחת, וטחנו רקמת בשר טחון עם מספריים עדינות או סכין גילוח. הוסף פתרון פפאין לצלחת התרבות ולהעביר רקמת קליפת המוח עם פתרון פפאין לצינור חרוט 15 מ”ל באמצעות פיפטה העברה סטרילית. דגירה רקמה ותמיסת אנזים ב 37 °C (60 °F) במשך 30 דקות, נסער כל 10 דקות. במהלך 30 דקות דגירה, להכין 3 פיפטות פסטר זכוכית מלוטשת אש: 1 פתוח לחלוטין, 1 חצי פתוח, ו 1 רבע פתוח. לאחר הדגירה של 30 דקות, צנטריפוגה צינור חרוט 15 מ”ל המכיל רקמות מוח מתעכל ב 125 x g במשך 10 דקות. הסר את פתרון האנזים והחלף בנפח שווה של מדיום Hibernate E טרי. באמצעות פיפטה פסטר פתוחה לחלוטין, triturate הרקמה 10x. תן לרקמה להסתפק 2 דקות, ולאחר מכן להעביר את השעיית התא supernatant לצינור חרוט סטרילי 50 מ”ל. הוסף נפח שווה של מדיום Hibernate E בחזרה לרקמה. שימוש חצי פתוח פסטר פיפטה, רקמת triturate 10x. תן לרקמה להסתפק 2 דקות, ולאחר מכן להעביר את ההשעיה תא supernatant לאותו צינור חרוט 50 מ”ל כמו בשלב הקודם. הוסף נפח שווה של מדיום Hibernate E בחזרה לרקמה. באמצעות רבע פתוח פסטר פיפטה, רקמת triturate 10x. תן לרקמה להסתפק 2 דקות, ואז להעביר את השעיית התא supernatant שוב לאותו חרוט 50 מ”ל כמו בשלבים קודמים. השלך את כל הרקמות שנותרו שלא ניתזו. צנטריפוגה הצינור חרוט 50 מ”ל המכיל את supernatant מן התא השעיה ב 125 x g במשך 5 דקות. אם עדיין לא נעשה, לשטוף צלחות מצופות פולי-D-ליצין עם מים סטריליים ולהסיר את כל עקבות של נוזל על ידי שאיפה יסודית במהלך צנטריפוגה. לאחר צנטריפוגה, להשליך את supernatant ו resuspend גלולה התא ב 5 מ”ל של נוירון צמיחה מדיה. לספור תאים חיים באמצעות כחול trypan ו hemocytometer. אם culturing נוירונים קליפת המוח, להוסיף לפחות 10 מ”ל של נוירון צמיחה מדיה עבור תאים צפופים פחות ספירה מדויקת יותר. לדלל תאים עם נוירון צמיחה מדיה עבור צפיפות ציפוי סופית של 5 x 105 תאים קיימא לכל מיליליטר ולהוסיף 1 מ”ל של השעיית תא מדולל לכל באר של צלחת 12 היטב. לשמור על נוירונים ב 37 °C (69 °F) עם 5% CO2.הערה: בדרך כלל, ההיפוקמפי ממוח עכבר עוברי אחד, כלומר, 2 היפוקמפי, מניב כ 1 x 106 תאים קיימא. מספר זה מסופק למטרות תכנון ניסויים בלבד ואין לראות בו תחליף לספירת תאים עבור כל תרבות. לשנות את מדיה הצמיחה יום אחרי תרבות על ידי הסרת מחצית נפח המדיה מכל באר, כלומר, 0.5 מ”ל, ולהוסיף נפח שווה של מדיה טרייה לצד של הבאר, כדי למנוע שיבוש התאים התרבותיים. חצי מדיה שלמה משתנה פעמיים בשבוע לתוחלת החיים של התרבות. 4. הערכת ביטוי MHCI על ידי ציטומטריית זרימה הכן טיפול על ידי דילול אינטרפרון בטא (IFNβ) או נפח שווה של diluent במדיה צמיחה נוירון. מאז שינוי מדיה יהיה שינוי חצי נפח, להכין את מדיית הטיפול עם 2x מרוכז IFNβ. כלומר, כדי לטפל 3 בארות של צלחת 12 גם עם 100 U / mL של IFNβ, להכין 1.5 מ”ל עם 200 U / mL IFNβ או נפח שווה של IFNβ diluent עבור פקדים שטופלו במדיה. הסר 0.5 מ”ל מכל באר של נוירונים ולהוסיף 0.5 מ”ל של נוירון צמיחה מדיה עם או בלי IFNβ לכל באר. דגירה בתנאי צמיחה רגילים (37 °C (37 °C, 5% CO2) עבור 6-72 שעות, בהתאם לתנאים ניסיוניים ואופטימיזציה אות. לאחר זמן הטיפול, להסיר את כל המדיה התרבותית בעדינות לשטוף פעם אחת במדיה נוירובאסלית קרה חסר תוספי מזון (B27, L-גלוטמין, עט-סטרפטוקוקוס). הוסף 0.5 מ”ל של מדיה נוירובסלית קרה ללא תוספת המכילה 1 מיקרוגרם / מ”ל של בלוק Fc ו 1 מיקרוגרם / מ”ל של נוגדן פלואורסצנטי מצומד נגד MHCI לכל באר. דגירה ב 4 מעלות צלזיוס מוגן מפני אור במשך 45 דקות. הסר מדיה המכילה נוגדנים ולשטוף בזהירות פעם אחת dPBS קר. הוסיפו 0.5 מ”ל של מאגר ניתוק תאים ללא אנזימים בטמפרטורת חדר לכל באר והתסיסו כדי לעקור תאים. היזהר דיסוציאציה באמצעות מיקרוסקופ תרבית רקמות הפוכה. לאחר התאים מנותקים צלחת תרבות, להוסיף 0.5 מ”ל של מאגר FACS לכל באר, תאים triturate לפזר גושים, ולהעביר את הנפח הכולל של כל באר בודדים 1.7 mL microcentrifuge צינורות. צנטריפוגה ב 1, 000 x g במשך 5 דקות. הסר את supernatant, resuspend גלולת התא ב 100 μL של מאגר FACS, ולהעביר את הנפח הכולל של כל צינור בארות בודדות של צלחת 96 גם U-bottom. הוסף 100 μL של מגיב מתקנת לכל באר. Triturate מספר פעמים כדי למנוע תאים גושים דגירה במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר מוגן מפני אור. צנטריפוגה ב 500 x גרם במשך 5 דקות. הסר את supernatant ו לשימוש חוזר ב 200 μl של מאגר FACS. צנטריפוגה ב 500 x גרם במשך 5 דקות. הסר את supernatant ו resuspend ב 100 μL של ריאגנט permeabilization המכיל נוגדן פלואורסצנטי מצומד נגד NeuN (1:100 דילול) לכל באר. מערבבים היטב, ואז דגירה בטמפרטורת החדר מוגן מפני אור עם נדנדה במשך 20 דקות. לאחר הדגירה, צנטריפוגה ב 500 x g במשך 5 דקות. הסר את supernatant ו לשימוש חוזר ב 100 μL של מאגר FACS. חזור על 2x. לאחר הכביסה הסופית, resuspend תאים ב 100 μL של 2% paraformaldehyde מדולל במאגר FACS. מערבבים היטב כדי למנוע תאים מגושם. יש לאחסן ב-4°C מוגן מפני אור עד שהוא מוכן לקריאה על ציטומטר זרימה. קרא דגימות בהקדם האפשרי, בתוך שבוע. 5. כימות והערכת נתונים למדוד את פקדי הפיצוי עבור כל צבע פלואורסצנטי ולתקן כל חפיפה ספקטרלית. בקרות פיצוי אידיאליות כוללות נוירונים תרבותיים שאינם מוכתמים, מוכתמים באנטי-MHCI בלבד ומוכתמים באנטי-נויN בלבד. במידת האפשר, רשום 100,000 אירועים עבור כל מדגם (לפחות 10,000) ושמור כקבצי FCS. כדי לנתח נתונים, באמצעות תוכנת ניתוח מתאימה, הגדר שערים רציפים, כמתואר באיור 1A-C לבחירה עבור נוירונים חיוביים של NeuN. התווה SSC-A (יומן) לעומת FSC-A (ליניארי). צייר שער על האוכלוסייה הסלולרית (P1) כדי לחסל פסולת הסלולר מהניתוח. בתוך אוכלוסיית הסלולר P1, התווה FSC-H (ליניארי) לעומת FSC-A (ליניארי). צייר שער על אוכלוסיית תא יחיד. בתוך אוכלוסיית התאים הבודדים, התווה SSC-A (יומן) לעומת NeuN (יומן רישום). צייר שער על אוכלוסייה חיובית של NeuN באמצעות תאים מוכתמים או מוכתמים ב- MHCI בלבד כמדריך. התווה היסטוגרמה של פלואורסצנטיות MHCI עם אירועים סלולריים מנורמלים למצב על ציר y. באמצעות נוירונים מוכתמים או מוכתמים ב- NeuN בלבד כמדריך, צייר שער אופקי כדי לכמת את אחוז הנוירונים החיוביים עבור MHCI. יצא את תאי האחוזים החיוביים עבור MHCI, כמו גם את עוצמת הפלואורסצנטיות החציונית (MFI) עבור MHCI באוכלוסייה החיובית של NeuN להערכה סטטיסטית ולציור גרפי.