Beoordeling van de expressie van major histocompatibiliteit complex klasse I op primaire murine hippocampale neuronen door flow cytometrie

Alle procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de aanbevelingen in de Guide for the Care and Use of Laboratory Animals van de National Institutes of Health en volgens de International Guiding Principles for Biomedical Research Involving Animals. Het protocol werd goedgekeurd door de Universiteit van North Carolina van het Charlotte Institutional Animal Care and Use Committee (Protocol #19-020). 1. Voorbereiding op cultuur OPMERKING: Deze procedures moeten worden uitgevoerd onder steriele omstandigheden in een bioveiligheidskast met weefselkweek. Zie tabel 1 voor media en oplossingen. Steriliseer alle dissectiegereedschappen door autoclaving in zelfsluitende sterilisatiezakken. Bereid werkvoorraden poly-D-lysine voor de behandeling van 12-well kweekgerechten. Los poly-D-lysine op in 1x boraatbuffer tot een concentratie van 100 μg/ml (10x geconcentreerd). Bewaar ongeveer 1 ml aliquots bij -20 °C tot het nodig is. Verdun 10x geconcentreerd poly-D-lysine in dPBS tot 10 μg/ml (1x) en steriliseer het filter. Behandel 12-put kweekplaten met 0,5 ml per put van 1x poly-D-lysine bij kamertemperatuur gedurende ten minste 1 uur of ‘s nachts voor gebruik de volgende dag. Zorg ervoor dat het volume poly-D-lysine voldoende is om de bodem van het kweekgebied volledig te bedekken. Verwijder vlak voor het gebruik poly-D-lysine van de kweekplaat, spoel 3x in steriel water en bewaar in steriel water totdat het klaar is om cellen te borderen. Verwijder alle sporen van vloeistof door een grondige aspiratie voorafgaand aan het plateren van cellen. Bereid Neuron Growth Media en FACS buffer voor. Filtreer steriliseren en bewaren bij 4 °C tot gebruik. Neuron Growth Media kan worden bewaard voor ongeveer 2 wks; FACS buffer kan ongeveer 4 wks worden bewaard. 2. Embryonale hippocampus ontleden OPMERKING: Deze procedure kan worden uitgevoerd op de benchtop omdat het gebruik van een stereomicroscoop vereist voor het verwijderen van hersenvliezen en microdissectie van de hippocampus. Houd u aan de strikte aseptische techniek om mogelijke besmetting te minimaliseren. Euthanaseer een getijde-zwangere C57BL/6J vrouwelijke muis op embryonale dag 18 in een CO2 kamer. Spray de buikhuid en vacht met 70% EtOH, knijp vervolgens de huid met weefseldop en maak een kleine incisie met een chirurgische schaar. Ingesneden het peritoneum om de ingewanden en baarmoeder bloot te stellen. Pak de baarmoeder vast met standaard patroon tang, til uit de holte en snijd de verbinding met het mesometrium met een fijne schaar. Breng de baarmoeder met embryo’s over naar een steriele plastic kweekschaal van 100 mm die op ijs is geplaatst. Snijd met een fijne schaar en fijne tang de baarmoeder voorzichtig door en verwijder de embryonale zakjes om embryo’s vrij te geven. Breng embryo’s over naar een nieuwe steriele plastic kweekschaal van 100 mm met dPBS die op ijs is geplaatst. Onthoofd embryonale pups met een fijne schaar en breng de koppen over naar een nieuwe steriele plastic kweekschaal van 100 mm met hibernate-E-medium dat op ijs is geplaatst. Om de hersenen te verwijderen, houdt u het hoofd met een paar fijne tangen in één hand. Met behulp van gebogen Dumont #7 tang in de andere hand, steek de punt van de tang aan de basis van de schedel en knijp het bot en de overlappende huid bewegen vooraan langs de middellijn zonder de hersenen te doorboren. Met behulp van gebogen tangen trekken de huid en schedel uit elkaar om de hersenen bloot te stellen. Veeg de gebogen tang onder de hersenen van de blootgestelde olfactorische bol naar het cerebellum om de hersenen uit de schedel te tillen. Breng de hersenen over naar een nieuwe steriele plastic kweekschaal van 100 mm met hibernate-E-medium dat op ijs is geplaatst. Herhaal dit voor elk brein.OPMERKING: Alle hersenen kunnen worden verzameld in één kweekschaal, tenzij ze gescheiden moeten zijn voor experimentspecifieke doeleinden. Onder een stereo dissectiemicroscoop, werkend met één brein tegelijk en twee paar steriele Dumont-#5 tang, knijp je reuklampen af en trek je hersenvliezen weg. Grondige verwijdering van de hersenvliezen is noodzakelijk om cultuurverontreiniging door andere cellen te voorkomen en verdere dissectie mogelijk te maken. Zodra hersenvliezen goed zijn verwijderd, opent de superieure kant van de cortex lateraal, wat de hippocampus zal blootstellen. Knijp met Dumont #5 tang de hippocampus weg van de aangekoppelde cortex en breng de geïsoleerde hippocampus voorzichtig over naar een steriele conische buis van 15 ml met 5 ml hibernate-E-medium op ijs. Herhaal de dissectie voor beide hersenhelften voor elke embryonale muispuppy en combineer alle hippocampi in een enkele conische buis van 15 ml, tenzij afzonderlijk nodig voor experimentspecifieke doeleinden. Om corticale neuronen te gekweekt, kan de cortex worden gescheiden van de subcortex en identiek worden verwerkt aan hippocampale neuronen.OPMERKING: Op dit punt kan het protocol worden onderbroken. Bewaar hersenen of ontleed hippocampi in sluimerstand-E medium aangevuld met B27 (2%) bij 4 °C gedurende maximaal 1 maand, hoewel langdurige vertraging het aantal levensvatbare cellen in gevaar kan brengen. 3. Dissocieren en cultiveren van hippocampale neuronen OPMERKING: Alle procedures moeten onder steriele omstandigheden worden uitgevoerd in een weefselkweek die is aangewezen als bioveiligheidskast. Bereid 0,5 ml pauselijke dissociatieoplossing per embryo voor hippocampale dissociatie. Het volume van de benodigde dissociatieoplossing zal variëren afhankelijk van het aantal embryonale hersenen dat wordt ontleed.OPMERKING: Bereid voor corticale neuroncultuur 1,0 ml papaïneoplossing per embryo. Los 20 μL papaïnesuspensie per 1 ml van het Sluimerstand E-medium op door ongeveer 3 minuten te vortexen. Nadat papaïne is opgelost, voegt u 1 μL DNase I per 1 ml van de oplossing toe. Draai de oplossing niet na DNase I toegevoegd, omdat dit het enzym kan deactiveren. Centrifugeer 15 ml conische buis met hippocampaal weefsel (stap 2.10) op 1,000 x g gedurende 5 min. Verwijder het supernatant en voeg papaïneoplossing toe. Resuspend het weefsel door meerdere keren om te keren. Incubeer gedurende 30 minuten bij 37 °C en keer om om het weefsel elke 10 minuten opnieuw te betepenzen. Als u corticale neuronen cultivert, breng dan alle cortices over naar een nieuwe steriele kweekschaal van 100 mm, aspireer voorzichtig media van de plaat en gehaktweefsel met een fijne schaar of scheermes. Voeg papaïne-oplossing toe aan de kweekschaal en breng corticale weefsel met papaïneoplossing over naar 15 ml conische buis met behulp van een steriele transferpipet. Incubeer weefsel en enzymoplossing bij 37 °C gedurende 30 minuten, elke 10 minuten roeren. Bereid gedurende 30 minuten incubatie 3 vuurgepolijste glazen Pasteur-pipetten voor: 1 volledig open, 1 half open en 1 kwart open. Centrifugeer na de incubatie van 30 minuten de conische buis van 15 ml met verteerde hersenweefsels gedurende 10 minuten op 125 x g. Verwijder de enzymoplossing en vervang door een gelijk volume vers Sluimer e-medium. Gebruik volledig open Pasteur pipet, triturate het weefsel 10x. Laat het weefsel 2 minuten bezinken en breng vervolgens de supernatante celsuspensie over in een steriele conische buis van 50 ml. Voeg een gelijk volume van Sluimerstand E medium terug aan het weefsel. Met behulp van half open Pasteur pipet, triturate weefsel 10x. Laat het weefsel 2 minuten bezinken en breng vervolgens de supernatante celsuspensie over naar dezelfde conische buis van 50 ml als in de vorige stap. Voeg een gelijk volume van Sluimerstand E medium terug aan het weefsel. Met behulp van kwart open Pasteur pipet, triturate weefsel 10x. Laat het weefsel 2 minuten bezinken en breng de supernatante celsuspensie vervolgens opnieuw over naar dezelfde 50 ml conische als in eerdere stappen. Gooi het resterende weefsel weg dat niet is gescheiden. Centrifugeer de 50 ml conische buis met het supernatant uit de celsuspensie gedurende 5 minuten op 125 x g. Als dit nog niet is gebeurd, wast u met poly-D-lysine bedekte platen met steriel water en verwijdert u alle sporen van vloeistof door grondige aspiratie tijdens centrifugeren. Gooi na centrifugeren het supernatant weg en resuspendeer de celkorrel in 5 ml neurongroeimedia. Tel levende cellen met trypan blauw en hemocytometer. Als u corticale neuronen cultieert, voeg dan ten minste 10 ml neurongroeimedia toe voor minder dichte cellen en nauwkeuriger tellen. Verdun cellen met Neuron Growth Media voor een uiteindelijke platingsdichtheid van 5 x10 5 levensvatbare cellen per ml en voeg 1 ml verdunde celsuspensie toe aan elke put van een plaat van 12 put. Neuronen op 37 °C houden met 5% CO2.OPMERKING: Meestal leveren de hippocampi uit 1 embryonale muizenhersenen, d.w.z. 2 hippocampi, ongeveer 1 x 106 levensvatbare cellen op. Dit nummer is uitsluitend bedoeld voor experimentplanningsdoeleinden en mag niet worden beschouwd als een vervanging voor het tellen van cellen voor elke cultuur. Verander de groeimedia de dag na de cultuur door de helft van het volume media uit elke put te verwijderen, d.w.z. 0,5 ml, en voeg een gelijk volume verse media toe aan de zijkant van de put om te voorkomen dat de gekweekte cellen worden verstoord. Voltooi twee keer per week halve mediaveranderingen voor de levensduur van de cultuur. 4. Beoordelen van MHCI expressie door flow cytometrie Bereid de behandeling voor door interferon bèta (IFNβ) of een gelijk volume verdunningsmiddel in neurongroeimedia te verdunnen. Aangezien mediaverandering een verandering van het halve volume zal zijn, bereidt u behandelingsmedia voor met 2x geconcentreerd IFNβ. d.w.z. om 3 putten van een 12-putplaat met 100 U/ml IFNβ te behandelen, bereidt u 1,5 ml voor met 200 U/ml IFNβ of een gelijk volume IFNβ-verdunningsmiddel voor mediabehandelde controles. Verwijder 0,5 ml uit elke put van neuronen en voeg 0,5 ml neurongroeimedia met of zonder IFNβ toe aan elke put. Incubeer in normale groeiomstandigheden (37 °C, 5% CO2)gedurende 6-72 uur, afhankelijk van experimentele omstandigheden en signaaloptimalisatie. Verwijder na de behandeling alle kweekmedia en was ze voorzichtig eenmaal in koude neurobasale media zonder supplementen (B27, L-glutamine, Pen-Strep). Voeg 0,5 ml niet-aangevulde koude neurobasale media met 1 μg/ml Fc-blok en 1 μg/ml fluorescerend geconjugeerd anti-MHCI-antilichaam toe aan elke put. Incubeer bij 4 °C beschermd tegen licht gedurende 45 minuten. Verwijder antilichaamhoudende media en was ze zorgvuldig eenmaal in koude dPBS. Voeg 0,5 ml enzymvrije celdissociatiebuffer op kamertemperatuur toe aan elke put en roer om cellen los te maken. Let op dissociatie met behulp van omgekeerde weefselkweekmicroscoop. Zodra cellen zijn losgemaakt van de kweekschaal, voegt u 0,5 ml FACS-buffer toe aan elke put, trituraatcellen om klonten te verspreiden en brengt u het totale volume van elke put over naar individuele 1,7 ml microcentrifugebuizen. Centrifugeer op 1.000 x g gedurende 5 min. Verwijder het supernatant, resuspend de celkorrel in 100 μL FACS-buffer en breng het totale volume van elke buis over naar afzonderlijke putten van een U-bodemplaat van 96 well. Voeg 100 μL fixatief reagens toe aan elke put. Tritureer meerdere keren om te voorkomen dat cellen klonteren en incuberen gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur beschermd tegen licht. Centrifugeer gedurende 5 min. op 500 x g. Verwijder het supernatant en resuspend in 200 μl FACS-buffer. Centrifugeer gedurende 5 min. op 500 x g. Verwijder het supernatant en resuspend in 100 μL permeabilisatiereagens dat fluorescerend geconjugeerd anti-NeuN-antilichaam (1:100 verdunning) in elke put bevat. Meng goed en incubeer vervolgens op kamertemperatuur beschermd tegen licht met schommelen gedurende 20 minuten. Na incubatie centrifugeer je gedurende 5 min op 500 x g. Verwijder het supernatant en resuspend in 100 μL FACS buffer. Herhaal 2x. Na de laatste wasbeurt resuspend cellen in 100 μL van 2% paraformaldehyde verdund in FACS buffer. Meng goed om te voorkomen dat cellen samenklonteren. Bewaren bij 4 °C beschermd tegen licht tot het klaar is om af te lezen op een flowcytometer. Lees de monsters zo snel mogelijk, binnen 1 week. 5. Kwantificeren en evalueren van gegevens Meet de compensatieregelaars voor elke fluorescerende kleurstof en corrigeer eventuele spectrale overlappingen. Ideale compensatiecontroles omvatten gekweekte neuronen die niet worden aangetast, alleen gekleurd met anti-MHCI en alleen gekleurd met anti-NeuN. Noteer indien mogelijk 100.000 gebeurtenissen voor elk monster (ten minste 10.000) en sla op als FCS-bestanden. Om gegevens te analyseren, met behulp van de juiste analysesoftware, stelt u sequentiële poorten in, zoals afgebeeld in figuur 1A-C om te selecteren op NeuN-positieve neuronen. Plot SSC-A (log) vs FSC-A (lineair). Teken een poort naar de cellulaire populatie (P1) om cellulair puin uit de analyse te verwijderen. Binnen de cellulaire P1-populatie, plot FSC-H (lineair) versus FSC-A (lineair). Teken een poort op eencellige populatie. Binnen de populatie met één cel plot SSC-A (log) versus NeuN (log). Teken een poort naar neun-positieve populatie met behulp van niet-bevlekte of MHCI-alleen bevlekte cellen als leidraad. Plot een histogram van MHCI-fluorescentie met cellulaire gebeurtenissen genormaliseerd naar modus op y-as. Gebruik niet-bevlekte of NeuN-only bevlekte neuronen als leidraad en teken een horizontale poort om het percentage neuronen te kwantificeren dat positief is voor MHCI. Exporteer de procentuele cellen positief voor MHCI, evenals de mediane fluorescentie-intensiteit (MFI) voor MHCI op de NeuN-positieve populatie voor statistische evaluatie en grafische tekening.