Modellierung der Hepatitis-B-Virusinfektion in nicht-hepatischen 293T-NE-3NRs-Zellen
Summary
Dieses Manuskript beschreibt ein detailliertes Protokoll zur Hepatitis-B-Virus-Infektion (HBV) in neuartigen 293T-Zellen (293T-NE-3NRs, die menschliche NTCP, HNF4, RXR und PPAR) und traditionelle Leberzellen (HepG2-NE, exzessizierenden menschlichen NTCP) exdrücken.
Abstract
HBV infiziert hauptsächlich menschliche Hepatozyten, aber es wurde auch gefunden, um extrahepatische Gewebe wie Niere und Hoden zu infizieren. Dennoch sind zellbasierte HBV-Modelle auf Hepatom-Zelllinien (wie HepG2 und Huh7) beschränkt, die einen funktionellen HBV-Rezeptor, Natrium-Taurochoat-Co-Transport-Polypeptid (NTCP), überausdrücken. Hier verwendeten wir 293T-NE-3NRs (293T überexpressing human NTCP, HNF4, RXR und PPAR) und HepG2-NE (HepG2 overexpressing NTCP) als Modellzellenlinien. Die HBV-Infektion in diesen Zelllinien wurde entweder unter Verwendung konzentrierter HBV-Viruspartikel aus HepG2.2.15 oder durch kokultivierende HepG2.2.15 mit den Zielzelllinien durchgeführt. HBcAg Immunfluoreszenz für HBcAg wurde durchgeführt, um HBV-Infektion zu bestätigen. Die beiden hier vorgestellten Methoden werden uns helfen, HBV-Infektionen in nicht-hepatischen Zelllinien zu untersuchen.
Introduction
Hepatitis B betrifft das Leben von mehr als 2 Milliarden Menschen und ist eine der größten Bedrohungen für die öffentliche Gesundheit. Weltweit sind rund 257 Millionen Menschen chronisch mit dem Hepatitis-B-Virus (HBV) infiziert, was dieGesellschaftschwer belastet 1 . Hepatozyten sind nicht die einzigen Zellen, die von HBV und anderen Zellen in nicht-hepatischem Gewebe infiziert sind, wie Niere und Hoden, sind auch mit diesem Virus infiziert2,3. Derzeit sind HBV-Infektionszellmodelle auf menschliche Hepatozyten mit nur wenigen nicht-hepatischen Zelllinienmodellen beschränkt. Dies behindert die Untersuchung der HBV-Infektion und der HBV-bedingten Pathologie von nicht-hepatischen Geweben. Hier stellen wir Protokolle zur Untersuchung der HBV-Infektion in nicht-hepatischen 293T-Zellen sowie in Häpatom-basierten Zellen vor.
Natriumtaurocholat Co-Transporting Polypeptid (NTCP) ist ein funktioneller Rezeptor für menschliche Hepatitis B und Hepatitis D Virus4. Hepatozyten-Kernfaktor 4 (HNF4), Retinoid-X-Rezeptor (RXR) und Peroxisomen-Proliferator-aktivierter Rezeptor (PPAR) sind leberangereicherte Transkriptionsfaktoren, die den viralen Tropismus von HBV einschränken. Sie wurden verifiziert, um die vorgenomische RNA-Synthese der HBV zu fördern und die HBV-Replikation in einer Nichthäpatom-Zelllinie5zu unterstützen. Wir konstruierten drei verschiedene Zelllinien, HepG2-Zelllinien, die NTCP (HepG2-NE), 293T-Zelllinie exzätsierend NTCP (293T-NE) und 293T Zelllinie, die vier Wirtsgene exizieren; NTCP, HNF4, RXR und PPAR (293T-NE-3NRs). Auf der Grundlage von 293T-NE-3NRs wurden zwei Methoden zur HBV-Infektion entwickelt (Abbildung 1). Die erste Methode verwendet die Impfung in 293T-NE-3NRs mit hoher viraler Genomäquivalenz (hohe GEq (150), DMSO und PEG8000) für 24 h. Die zweite Methode verwendet co-culturing 293T-NE-3NRs mit HepG2.2.15, die HBV-Partikel (niedrige GEq (ca. 1,83) ohne DMSO und PEG8000 produzieren können, wodurch die natürlichen Bedingungen eng nachgeahmt werden.
HepG2.2.15-Zellen werden aus der HepG2-Linie abgeleitet und seiteln chronisch infektiöse HBV sowie subvirale Partikel in das Kulturmedium6,7. Cyclosporin A (CsA) ist ein Immunsuppressivum, das klinisch zur Unterdrückung der Xenograft-Abstoßung verwendet wird. Studien haben gezeigt, dass CsA den HBV-Eintrag in kultivierte Hepatozyten hemmt, indem es die Transporteraktivität von NTCP hemmt und die Bindung von NTCP an große Hüllproteine blockiert8.
HepG2-NE-Zellen wurden als Positivkontrolle verwendet, während CsA-behandelte Zellen als Negativkontrolle verwendet wurden. Im Vergleich zu den positiven und negativen Kontrollgruppen können wir herausfinden, welche Wirtsgene bei der HBV-Infektion eine entscheidende Rolle spielen. Darüber hinaus können wir durch diese Art der HBV-Infektion auch andere neuartige Mechanismen oder Wirtsgene finden, die an einer HBV-Infektion beteiligt sind.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier führen wir Protokolle für HBV-Infektionen in nicht-hepatischen 293T-NE-3NRs und Hepatom-basierten HepG2-NE-Zellen ein. 293T-NE-3NRs waren sowohl bei hohen als auch niedrigen GEq-Infektionen für HBV-Infektionen geeignet. Bei der Verwendung unseres Protokolls müssen die folgenden kritischen Schritte berücksichtigt werden. Der Zellstatus ist ein wichtiger Faktor für eine erfolgreiche Infektion. Das Infektionsmedium muss rechtzeitig nach der Anfangsperiode der HBV-Infektion gewechselt werden. 293T-NE-3NRs-Zellen s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (Nr. 81870432 und 81570567 bis X.L.Z.), (Nr. 81571994 bis P.N.S.), Research Fund for International Young Scientists (Nr. 81950410640 bis W.I.) unterstützt. Die Li Ka Shing Shantou University Foundation (Nr. L1111 2008 bis P.N.S.). Wir danken Prof. Stanley Lin vom Shantou University Medical College für ihre sachdienliche Beratung.
Materials
| 0.45μm membrane filter | Millex-HV | SLHU033RB | Filter for HepG 2.2.15 supernatant |
| 293T-NE | Laboratory construction | —— | Cell model for HBV infection |
| 293T-NE-3NRs | Laboratory construction | —— | Cell model for HBV infection |
| 594 labeled goat against rabbit IgG | ZSGB-BIO | ZF-0516 | For immunofluorescence assay,second antibody |
| 6-well plate | BIOFIL | TCP010006 | For co-culture |
| Amicon Ultra 15 ml | Millipore | UFC910008 | For concentration of HepG 2.2.15 supernatant |
| BSA | Beyotime | ST023 | For immunofluorescence assay |
| Cyclosporin A | Sangon biotech | 59865-13-3 | inhibitor of HBV infection |
| DAPI | Beyotime | C1006 | For nuclear staining |
| Diagnostic kit for Quantification of Hepatitis B Virus DNA(PCR-Fluorescence Probing) | DAAN GENE | 7265-2013 | For HBV DNA detection |
| DMEM | HyClong | SH30243.01 | For culture medium |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D5879 | For improvement of infection efficiency |
| Fetal bovine serum（FBS） | CLARK Bioscience | FB25015 | For culture medium |
| Fluorescence microscope | ZEISS | Axio observer Z1 | For immunofluorescence assay |
| HepG2-NE | Laboratory construction | —— | Cell model for HBV infection |
| HBcAg antibody | ZSGB-BIO | ZA-0121 | For immunofluorescence assay, primary antibody |
| PBS | ZSGB-BIO | ZLI-9062 | For cell wash |
| PEG8000 | Merck | P8260 | For infection medium |
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine | Thermo Fisher | 10378016 | For culture medium |
| Transwell | CORNING | 3412 | For co-culture |
| Tween 20 | sigma-Aldrich | WXBB7485V | For PBST |
| Virkon | Douban | 6971728840012 | Viruside |
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