Ekstra Hücresel Matris Tabanlı ve Ekstra Hücresel Matrissiz Murine Testiküler Organoidlerin Üretimi
Summary
Burada primer neonatal murine testis hücrelerinden testis organoidi üretmek için dört yöntem tanımlanmıştır. Bu teknikler birden fazla araştırma uygulamasına sahiptir ve özellikle testis gelişimi ve fizyolojisi in vitro eğitimi için yararlıdır.
Abstract
Testis organoidleri in vitro testis gelişimi, spermatogenez ve endokrinolojiyi incelemek için bir araç sağlar. Testis organoidleri oluşturmak için çeşitli yöntemler geliştirilmiştir. Bu yöntemlerin çoğu de novo doku montajını teşvik etmek için hücre dışı matriks (ECM) güveniyor, ancak, biyomimetik morfolojisi ve dokuların fonksiyonu açısından yöntemler arasında farklılıklar vardır. Ayrıca, yayınlanan yöntemlerin birkaç doğrudan karşılaştırmalar vardır. Burada organoid üretim protokollerinde sağlanan sonuçlarla ilgili farklılıklar incelenerek doğrudan bir karşılaştırma yapılır. Dört arketipik nesil yöntemi: (1) 2D ECM’siz, (2) 2D ECM, (3) 3D ECM’siz ve (4) 3D ECM kültürü tanımlanmıştır. Testis organoid neslini değerlendirmek için üç ana kriter kullanıldı. Bunlar hücresel öz-montaj, büyük hücre tiplerinin dahil edilmesi (Sertoli, Leydig, mikrop ve peritubüler hücreler) ve uygun şekilde bölümlere ayrılmış doku mimarisidir. Test edilen dört ortamdan 2D ECM ve 3D ECM’siz kültürler, tübüler ve interstisyel hücre tiplerinin de novo kompartmanlaşması, tübüle benzeri yapıların geliştirilmesi ve uzun süreli endokrin fonksiyon dahil olmak üzere iç morfolojilere sahip organoidler üretti. İncelenen tüm yöntemlerde sıralanmamış, primer murine testis hücre süspansiyonları kullanılmıştır ve yaygın olarak erişilebilir kültür kaynakları kullanılmıştır. Bu testis organoid oluşturma teknikleri, testis organogenezi ve in vitro fizyolojisi araştırma girişimleri için son derece erişilebilir ve tekrarlanabilir bir araç seti sağlar.
Introduction
Testis organoidleri testis gelişimi, spermatogenez ve in vitro1,2,,3,,4fizyolojisi üzerinde çalışmak için öncü bir tekniktir. Organoid nesil için çeşitli yöntemler araştırılmıştır; bunlar, hem iki boyutlu (2B) hem de üç boyutlu (3D) oryantasyonlarda çeşitli hücre dışı matris (ECM) ve ECM içermeyen kültür sistemlerini içerir. Farklı nesil yöntemleri farklı hücresel montaj stratejileri teşvik edebilir; bu da yayınlanmış organoid modeller arasında yüksek düzeyde morfolojik ve fonksiyonel değişkenlik ile sonuçlanır. Bu makalenin amacı in vitro testis modellerinin mevcut durumunu tartışmak ve testis organoid deneylertasarlarken, gelecekteki araştırmacılar için bir şablon olarak hizmet etmektir. Bu çalışmada, deneysel süreç ve biyolojik sonuç olarak dört farklı kültür sistemi arketipi tanımlanmış ve karakterize edilse de. Bunlar: 2D ECM’siz, 2D ECM, 3D ECM-Free ve 3D ECM kültür yöntemleri. Burada sunulan stratejilerin farklı laboratuvarlar ve araştırma grupları arasında basit, erişilebilir ve son derece tekrarlanabilir olması amaçlanmıştır.
Tarihsel testisler için, “in vitro” adı, testis dokuları ve hücrelerinin birkaç farklı kültür yöntemleri için kullanılmıştır. Bunlar arasında organotipik doku/organ kültürü yöntemleri (örn. eksplant kültürü)5,izole seminiferous tübül kültürü6, testis hücre kültürü7, de novo doku morfogenezi (yani, biyolojik yapılar ve organoidler)1. In vitro spermatogenez ile ilgili ilk araştırmalar yaklaşık 100 yıl önce, tavşan testis explants kültürü ile 19208, ve daha sonra 1937 yılında fare eksplants9ile yapılmıştır . Bu ilk deneylerde spermatogonia’nın kültürün ilk haftasında büyük ölçüde dejenere olduğu gözlenmiştir, ancak bazı meiotically ayırıcı hücreler tanımlanmıştır. Bu tarihsel raporları hatırlatan testis explant kültürü 2011 yılında yeniden canlandırıldı ve testis10’unincelenmesi için uygun bir teknik haline getirilmiş ve optimize edilebilmektedir. 2011 yılından bu yana, eksplant kültürü birden fazla rapor11,12,,13doğurganlık yetkili sperm üretti. Ancak, explant kültürünün önceden var olan yerli testis tübüllerine olan güveni nedeniyle, bu son gelişmeler daha doğru bir şekilde “ex vivo” testiküler fonksiyon ve spermatogenez, bir organizmanın vücudundan çıkarıldıktan sonra sürdürülen veya sürdürülen doku fonksiyonunun örnekleri olarak tanımlanır. Literatürde yaygınlığına rağmen, testis ekseksilerde uzun süreli germ hücre bakımı ve farklılaşması14, 15,,1616,17,18, özellikle in vitro spermatogenezi tam olarak gözlemlemek için yeterince uzun zaman dilimleri nde (~35 gün farelerde19 ve 74 insanlarda20)çoğaltmak zordur. Bu 100 yıl önce yaşanan aynı zorlukların çoğu, hala ex vivo spermatogenesis bugün içinde deneyimli olduğunu takdir etmek ilginçtir.
Ex vivo yaklaşımlardan farklı olarak, testis organoidleri hücresel kaynaklardan (yani primer testis hücrelerinden) tamamen in vitro olarak üretilen de novo birleştirilmiş mikrodokulardır. Testis organoidleri, alanın önceden var olan doğal dokuya olan tarihsel güvenini aşmak ve testis biyolojisini tamamen in vitro olarak yeniden özetlemek için yaratıcı bir strateji sağlar. Çoğu organoid doku modeli tarafından paylaşılan birden fazla gereksinim vardır; bunlar arasında (1) in vivo-mimetik doku morfolojisi veya mimarisi, (2) temsil edilen dokunun birden fazla ana hücre tipi, (3) kendi kuşağında kendi kendini birleştirme veya kendi kendine örgütlenme, ve (4) temsil edilen dokunun fonksiyonu ve fizyolojisinin bir kısmını simüle etme yeteneği21,22,23 ,23,24. Testisler için, bu dört ana işaretle yakalanabilir: (1) majör testis hücre tiplerinin dahil edilmesi, mikrop, Sertoli, Leydig, peritubular ve diğer interstisyel hücreler, (2) hücre yönelimli doku montajı, (3) uygun şekilde bölümlere ayrılmış hücre tipleri ayrı tübüler bölmelere (mikrop ve Sertoli) ve interstisyel bölgelere (diğer tüm hücre tipleri) ve (4) bir derecedoku fonksiyonu (örneğin, üreme hormonu salgılanması veya doku yanıtları ve germ bakım hücre ve selamiasyon). Germ hücre farklılaşması ex vivo ve in vitro bakımında tarihsel zorluklar göz önüne alındığında, in vivo-mimetik testis mimarileri recapitulation (yani, seminiferous tübüller benzeyen yapılar) testis fizyolojisi simülasyonu öneren ek belirteçleri ile (örneğin, endokrin fonksiyon), bir gün vitrospermatoto sürdürmek olabilir organoidler üreten doğru öncelikli kilometre taşlarıdır.
Yayınlanan testis organoid yöntemlerin çoğunluğu ticari olarak kullanılabilir ECM yararlanmak (örneğin, kollajen veya tescilli ECM formülasyonları)25,26,27 veya özel kaynaklı EMI’ler (yani, hücreli testis ECM kaynaklı hidrojeller)28,29,30. Eksojen ECM doku üretimi için montaj destekleyici iskele sağlayarak de novo doku oluşumunu teşvik eder. ECM yöntemleri doku oluşumu etkileyici bir düzeyde, bazı germ hücre varlığı ve doku-mimetikmorfolojisi 25,,28dahil olmak üzere göze almış. Ancak, kullandıkları EkM’ler her zaman evrensel olarak mevcut değildir (örneğin, hücredışı ECM kaynaklı hidrojeller) ve bazı yöntemler sofistike jel ve hücre tohumlama oryantasyonları gerektirir (örneğin, ECM ve 3D baskı 3 katmanlı degradeler)25,31,32. İskele içermeyen yöntemler (örneğin, asma damla ve yapışmaz kültür plakaları)33,34,35 de ECM jelleri veya iskeleler gerek kalmadan sağlam ve son derece tekrarlanabilir organoidler üretti. Ancak, bu iskele içermeyen organoidlerin doku morfolojisi genellikle in vivo testisler farklı, ve bu raporların çoğu doku oluşumunu teşvik etmek için bir biyokimyasal ECM katkı dahil33,34,36, ya da alternatif olarak, zorla hücre toplama ve sıkıştırma için santrifüj güveniyor34, onları hücre yönelimli göç ve kendi kendine organizasyon eğitimi için daha az ideal hale.
Bu el yazmasında sunulan dört organoid üretim yöntemi, her biri hücre güdümlü organoid öz montajın gözlemlenmesini sağlayan basit hücre tohumlamalarını kullanan, Hem ECM’ye bağlı hem de bağımsız stratejileri içermektedir. Dört teknik de aynı hücre süspansiyonlarından gerçekleştirilebilir veya özel ve hücre tipi zenginleştirilmiş popülasyonlardan yararlanabilir. Bu yöntemlerin bir gücü organoidlerin gerçek zamanlı olarak kendi kendine biraraya gelip testis yapılarının farklı kültür mikroortamları arasında nasıl biraraya getirildiğini doğrudan karşılaştırma yeteneğidir. Bu dört kültür yöntemi arasındaki phenotipik farklılıklar araştırma sorusu veya araştırmacının konusu üzerindeki etkileri açısından göz önünde bulundurulmalıdır. Her yöntem 24 saat veya daha az içinde biyolojik yapılar veya organoidler üretir. Sonuç olarak, burada sunulan yöntemler, testis organoid montaj, doku gelişimi ve testis fizyolojisi in vitro incelenmesi için organoid montaj teknikleri bir araç seti sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu organoid nesil protokolünün tamamlanması ile, kullanıcı testis yapıları ve organoidler ecm veya ECM içermeyen ortamlarda montajı için onlara mevcut dört farklı kültür teknikleri olacaktır. Daha da önemlisi, dört yöntem de araştırmacının zaman atlamalı görüntüleme veya video kaydı yoluyla organoid kendi kendini birleştirmeyi zaman içinde non-invaziv olarak gözlemlemesine ve kültür sırasında dokuları rahatsız etmeden salgılanan hormonların ve sitokinlerin analizi için koşullandır…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri, Ulusal Çocuk Sağlığı ve İnsangelişimi Enstitüsü (NICHD) F31 HD089693, Ulusal Çevre Sağlığı Bilimleri Enstitüsü / Ulusal Merkezi İlerletme Çeviri Bilimleri (NIEHS/NCATS) UH3TR001207 ve 4UH3ES029073-03 ve Thomas J. Watkin’s Professor Memorialship tarafından finanse edilmiştir.
Yazarlar iletim elektron mikroskobu ile yardım için Eric W. Roth teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma, Yumuşak ve Hibrid Nanoteknoloji Deneysel (SHyNE) Kaynak (NSF ECCS-1542205) destek aldı Northwestern Üniversitesi’nin NUANCE Merkezi, BioCryo tesisi kullanımı yaptı; Malzeme Araştırma Merkezi’ndeki MRSEC programı (NSF DMR-1720139); Uluslararası Nanoteknoloji Enstitüsü (IIN); ve Illinois Eyaleti, IIN aracılığıyla. Ayrıca MRI programından (NSF DMR-1229693) destek alan CryoCluster ekipmanından da yararlanmıştır. Şekil 1’deki grafikler BioRender.com kullanılarak tasarlanmıştır.
Materials
| 0.22 um Media Sterile Filters | Millipore Sigma | scgpu05re | For sterile filtering media |
| 3βHSD primary antibody | Cosmo Bio Co | K0607 | Leydig cell marker, 1:500 dilution |
| AlexaFluor 568 α-Mouse | Thermo Fisher Scientific | A-21202 | Fluorescence-tagged secondary antibody |
| AlexaFluor 568 α-Rabbit | Thermo Fisher Scientific | A10042 | Fluorescence-tagged secondary antibody |
| Alpha Minimum Essential Medium | Thermo Fisher Scientific | 11-095-080 | Base of culture media |
| Collagenase I | Worthington Bio | LS004197 | For dissociation solution 1 |
| Corning Matrigel Membrane Matrix, LDEV-free | Corning | 354234 | Extracellular matrix used for casting 2D and 3D ECM culture gels |
| Countess Cell counter | Thermo Fisher Scientific | C10227 | Autmated cell counter (hemacytometer machine) |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Thermo Fisher Scientific | C10228 | Hemacytometer slide for use with Countess automated counter |
| DDX4 primary antibody | Abcam | 138540 | Spermatogonia marker, 1:500 dilution |
| Deoxyribonuclease I (2,280 u/mgDW) | Worthington Bio | LS002140 | For dissociation solution 1 |
| DPBS 1X, + CaCl + MgCl | Thermo Fisher Scientific | 14040182 | For reconstituting Hyaluronidase |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline +Ca/+Mg | Thermo Fisher Scientific | 14040117 | PBS |
| Embryo Grade H2O | MIllipore Sigma | W1503 | For reconstituting Collagenase I and Dnase I |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | For quencing enzyme dissocation solutions |
| Follicle stimulating hormone | Abcam | ab51888 | For long-term organoid culture |
| Human chorionic gonadotropin | Millipore Sigma | C1063 | For long-term organoid culture |
| Hyaluronidase, from bovine testes | Millipore Sigma | H4272 | For dissociation solution 2 |
| Inhibin B Enzyme-linked Immunosorbent Assay | Ansh Labs | AL-107 | Inhibin B ELISA Kit |
| KnockOut Serum Replacement | Thermo Fisher Scientific | 10828-028 | Serum source for Basal media |
| MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold spheroids (24-35, 5×7 array) | Millipore Sigma | Z764051 | For 3D ECM-Free organoid fabrication |
| Nunc, Lab Tek II Chamber Slide System, 4-well | Thermo Fisher Scientific | 12-565-7 | For 2D ECM-free, and 2D, 3D ECM culture |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15-140-122 | Antibiotic for media |
| Richard-Allan Scientific; Histogel, Specimen processing gel | Thermo Fisher Scientific | HG-4000-012 | For aiding paraffin embedding |
| SOX9 primary antibody | Millipore Sigma | AB5535 | Sertoli Marker, 1:500 dilution |
| Tedklad Global Mouse Chow (Breeder) | Teklad Global | 2920 | Mouse food without phytoestrogens |
| Tedklad Global Mouse Chow (Maintenance) | Teklad Global | 2916 | Mouse food without phytoestrogens |
| Testosterone Enzyme-linked Immunosorbent Assay | Calbiotech | TE373S | Testosterone ELISA Kit |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | For cell counting |
| αSMA primary antibody | Millipore Sigma | A2547 | Peritubular marker, 1:500 dilution |
| βCatenin primary antibody | BD Biosciences | 610154 | Sertoli Cytoplasm marker, 1:100 dilution |
References
- Alves-Lopes, J. P., Stukenborg, J. B. Testicular organoids: a new model to study the testicular microenvironment in vitro. Human Reproduction Update. 24 (2), 176-191 (2018).
- Komeya, M., Sato, T., Ogawa, T. In vitro spermatogenesis: A century-long research journey, still half way around. Reproductive Medicine and Biology. 17 (4), 407-420 (2018).
- Sakib, S., Goldsmith, T., Voigt, A., Dobrinski, I. Testicular organoids to study cell-cell interactions in the mammalian testis. Andrology. , 12680 (2019).
- Gargus, E. S., Rogers, H. B., McKinnon, K. E., Edmonds, M. E., Woodruff, T. K. Engineered reproductive tissues. Nature Biomedical Engineering. 4 (4), 381-393 (2020).
- Sato, T., et al. In vitro production of functional sperm in cultured neonatal mouse testes. Nature. 471 (7339), 504-507 (2011).
- Eddy, E. M., Kahri, A. I. Cell associations and surface features in cultures of juvenile rat seminiferous tubules. The Anatomical Record. 185 (3), 333-357 (1976).
- Dietrich, A., SCholten, R., Vink, A., Oud, J. Testicular cell suspensions of the mouse in vitro. Andrologia. 15, 236-246 (1983).
- Champy, C. De la méthode de culture des tissus. VI. Le testicule. Archives de Zoologie Experimentale Generale. 60, 461-500 (1920).
- Martinovitch, P. The development in vitro of the mammalian gonad. Ovary and ovogenesis. Proceedings of the Royal Society B of Biological Sciences. 125, 232-249 (1938).
- Sato, T., et al. In vitro production of fertile sperm from murine spermatogonial stem cell lines. Nature communications. 2, 472 (2011).
- Komeya, M., et al. Long-term ex vivo maintenance of testis tissues producing fertile sperm in a microfluidic device. Scientific Reports. 6 (1), 21472 (2016).
- Sanjo, H., et al. In vitro mouse spermatogenesis with an organ culture method in chemically defined medium. PLoS One. 13 (2), 0192884 (2018).
- Komeya, M., et al. In vitro spermatogenesis in two-dimensionally spread mouse testis tissues. Reproductive Medicine and Biology. 18 (4), 362-369 (2019).
- Reda, A., et al. In vitro differentiation of rat spermatogonia into round spermatids in tissue culture. Molecular Human Reproduction. 22 (9), 601-612 (2016).
- Reda, A., et al. Knock-Out Serum Replacement and Melatonin Effects on Germ Cell Differentiation in Murine Testicular Explant Cultures. Annals of Biomedical Engineering. 45 (7), 1783-1794 (2017).
- Chapin, R. E., et al. Lost in translation: The search for an in vitro screen for spermatogenic toxicity. Birth Defects Research Part B – Developmental and Reproductive Toxicology. 107 (6), 225-242 (2016).
- Portela, J. M. D., et al. Strains matter: Success of murine in vitro spermatogenesis is dependent on genetic background. Developmental Biology. 456 (1), 25-30 (2019).
- Gholami, K., et al. The air-liquid interface culture of the mechanically isolated seminiferous tubules embedded in agarose or alginate improves in vitro spermatogenesis at the expense of attenuating their integrity. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 56 (3), 261-270 (2020).
- Oakberg, E. F. Duration of spermatogenesis in the mouse and timing of stages of the cycle of the seminiferous epithelium. American Journal of Anatomy. 99 (3), 507-516 (1956).
- Amann, R. P. The cycle of the seminiferous epithelium in humans: A need to revisit. Journal of Andrology. 29 (5), 469-487 (2008).
- Clevers, H. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125 (2014).
- Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. Progress and potential in organoid research. Nature Reviews Genetics. 19 (11), 671-687 (2018).
- Takahashi, T. Organoids for Drug Discovery and Personalized Medicine. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 59, 447-462 (2019).
- Alves-Lopes, J. P., Söder, O., Stukenborg, J. B. Testicular organoid generation by a novel in vitro three-layer gradient system. Biomaterials. 130, 76-89 (2017).
- Lee, J. H., Kim, H. J., Kim, H., Lee, S. J., Gye, M. C. In vitro spermatogenesis by three-dimensional culture of rat testicular cells in collagen gel matrix. Biomaterials. 27 (14), 2845-2853 (2006).
- Zhang, J., Hatakeyama, J., Eto, K., Abe, S. I. Reconstruction of a seminiferous tubule-like structure in a 3 dimensional culture system of re-aggregated mouse neonatal testicular cells within a collagen matrix. General and Comparative Endocrinology. 205, 121-132 (2014).
- Vermeulen, M., et al. Development of a Cytocompatible Scaffold from Pig Immature Testicular Tissue Allowing Human Sertoli Cell Attachment, Proliferation and Functionality. International Journal of Molecular Sciences. 19 (1), 227 (2018).
- Baert, Y., et al. Derivation and characterization of a cytocompatible scaffold from human testis. Human Reproduction. , 1-12 (2014).
- Baert, Y., Rombaut, C., Goossens, E. Scaffold-Based and Scaffold-Free Testicular Organoids from Primary Human Testicular Cells. Methods in Molecular Biology. 1576, 283-290 (2019).
- Alves-Lopes, J. P., Söder, O., Stukenborg, J. B. Use of a three-layer gradient system of cells for rat testicular organoid generation. Nature Protocols. 13 (2), 248-259 (2018).
- Baert, Y., Dvorakova-Hortova, K., Margaryan, H., Goossens, E. Mouse in vitro spermatogenesis on alginate-based 3D bioprinted scaffolds. Biofabrication. 11 (3), 035011 (2019).
- Pendergraft, S. S., Sadri-Ardekani, H., Atala, A., Bishop, C. E. Three-dimensional testicular organoid: a novel tool for the study of human spermatogenesis and gonadotoxicity in vitro. Biology of Reproduction. 96 (3), 720-732 (2017).
- Sakib, S., et al. Formation of organotypic testicular organoids in microwell culture. Biology of Reproduction. 100 (6), 1648-1660 (2019).
- Cameron, D. F., et al. Formation of Sertoli Cell-Enriched Tissue Constructs Utilizing Simulated Microgravity Technology. Annals of the New York Academy of Sciences. 944 (1), 420-428 (2006).
- Strange, D. P., et al. Human testicular organoid system as a novel tool to study Zika virus pathogenesis. Emerging Microbes & Infections. 7 (1), 1-7 (2018).
- Edmonds, M. E., Woodruff, T. K. Testicular organoid formation is a property of immature somatic cells, which self-assemble and exhibit long-term hormone-responsive endocrine function. Biofabrication. 12 (4), 045002 (2020).
- Baert, Y. Primary Human Testicular Cells Self-Organize into Organoids with Testicular Properties. Stem Cell Reports. 8 (1), 30-38 (2017).
- Pinto, M. P., Jacobsen, B. M., Horwitz, K. B., Maggiolini, M. An immunohistochemical method to study breast cancer cell subpopulations and their growth regulation by hormones in three-dimensional cultures. Front Endocrinol (Lausanne). 2, 15 (2011).
- Brinster, R. L. Germline stem cell transplantation and transgenesis. Science. 296 (5576), 2174-2176 (2002).
- Hue, D., et al. Meiotic Differentiation of Germinal Cells in Three-Week Cultures of Whole Cell Population from Rat Seminiferous Tubules. Biology of Reproduction. 59 (2), 379-387 (1998).
- Zhou, Q., et al. Complete Meiosis from Embryonic Stem Cell-Derived Germ Cells in Vitro. Cell Stem Cell. 18 (3), 330-340 (2016).
- Kanatsu-Shinohara, M., et al. Long-Term Proliferation in Culture and Germline Transmission of Mouse Male Germline Stem Cells. Biology of Reproduction. 69 (2), 612-616 (2003).
- Helsel, A. R., Oatley, M. J., Oatley, J. M. Glycolysis-Optimized Conditions Enhance Maintenance of Regenerative Integrity in Mouse Spermatogonial Stem Cells during Long-Term Culture. Stem Cell Reports. 8 (5), 1430-1441 (2017).
- Sato, T., et al. In vitro spermatogenesis in explanted adult mouse testis tissues. PLoS One. 10 (6), 0130171 (2015).
- Xiao, S., et al. A microfluidic culture model of the human reproductive tract and 28-day menstrual cycle. Nature Communications. 8 (1), 1-13 (2017).
- Skardal, A., et al. Drug compound screening in single and integrated multi-organoid body-on-a-chip systems. Biofabrication. 12 (2), 025017 (2020).
