Extra Cellular Matrix-Based y Extra Cellular Matrix-Free Generation of Murine Testicular Organoids

Los organoides testiculares son una técnica pionera para el estudio del desarrollo testicular, la espermatogénesis y la fisiología in vitro^1,2,3,4. Se han explorado varios métodos para la generación de organoides; estos incluyen una variedad de sistemas de cultivo libre de ECM y matriz extracelular (ECM), tanto en orientaciones bidimensionales (2D) como tridimensionales (3D). Diferentes métodos de generación pueden promover estrategias de ensamblaje celular distintas; esto da como resultado un alto nivel de variabilidad morfológica y funcional entre los modelos organoides publicados. El propósito de este artículo es discutir el estado actual de los modelos testiculares in vitro, y servir como una plantilla para futuros investigadores, al diseñar experimentos organoides testiculares. Dentro del presente estudio, se definen y caracterizan cuatro arquetipos diferentes del sistema de cultivo en el proceso experimental y el resultado biológico. Estos incluyen: 2D ECM-Free, 2D ECM, 3D ECM-Free, y 3D ECM métodos de referencia cultural. Las estrategias presentadas en el presente documento pretenden ser sencillas, accesibles y altamente reproducibles entre diferentes laboratorios y grupos de investigación.

Históricamente para los testículos, la designación “in vitro”, se ha utilizado para varios métodos de cultivo diferentes de tejidos testiculares y células. Estos incluyen métodos de cultivo de tejidos/órganos organotípicos (es decir, cultivo de explantes)⁵, cultivo aislado de tubulos semíferos^6,cultivo celular testicular⁷, y métodos de morfogénesis de tejido de novo (es decir, construcciones biológicas y organoides)¹. Las primeras investigaciones sobre espermatogénesis in vitro se realizaron hace aproximadamente 100 años, con el cultivo de conejo testis explants en 1920^8,y más tarde en 1937 con explantes de ratón⁹. Dentro de estos experimentos iniciales se observó que la espermatogonia degeneraba en gran medida a lo largo de la primera semana de cultivo, aunque se identificaron algunas células meiotically diferenciadoras. Reminiscente de estos informes históricos, el cultivo de explant testis fue revivido y optimizado en 2011 para convertirse en una técnica factible para el estudio de los testis^10. Desde 2011, el cultivo de explant ha producido espermatozoides competentes para la fertilidad en múltiples informes^11,12,13. Sin embargo, debido a la dependencia del cultivo explantado de los túbulos nativos preexistentes, estos avances recientes se describen con mayor precisión como ejemplos de función testicular “ex vivo” y espermatogénesis, función tisular que se mantuvo o se reanudó al extraerse del cuerpo de un organismo. A pesar de su prevalencia en la literatura, el mantenimiento y la diferenciación de células germinales a largo plazo dentro de los explantes testiculares es difícil replicar^14,15,16^,17,18, especialmente en los períodos de tiempo suficiente para observar completamente la espermatogénesis in vitro (35 días en ratones¹⁹ y 74 en humanos²⁰).¹⁸ Es intrigante apreciar que muchos de los mismos desafíos experimentados hace 100 años, todavía se experimentan dentro de la espermatogénesis ex vivo hoy en día.

Diferentes de los enfoques ex vivo, los organoides testiculares son microtiss ensambladas de novo generadas enteramente in vitro a partir de fuentes celulares (es decir, células testiculares primarias). Los organoides testiculares proporcionan una estrategia creativa para eludir la dependencia histórica del campo del tejido nativo preexistente, y para recapitular la biología testicular completamente in vitro. Hay múltiples requisitos compartidos por la mayoría de los modelos de tejido organoides; estos incluyen (1) morfología o arquitectura de tejido in vivo-mimético, (2) múltiples tipos celulares principales del tejido representado, (3) autoensamble o auto-organización en su generación, y (4) la capacidad de simular algún nivel de la función del tejido representado y la fisiología^{21,,22,,23,,24}. Para los testículos, esto se puede capturar en cuatro señas de identidad principales: (1) la inclusión de los principales tipos de células testiculares, germen, Sertoli, Leydig, células peritubulares y otras células intersticiales, (2) conjunto de tejidos dirigidos por células, (3) tipos de células adecuadamente compartimentadas en compartimentos tubulares separados (germen y sertoli) y regiones intersticiales (todos los demás tipos de células), y (4) cierto grado de función tisular (por ejemplo, secreción de hormonas reproductivas o respuestas de tejidos, y mantenimiento y diferenciación de células germinales). Teniendo en cuenta los desafíos históricos en el mantenimiento de la diferenciación de células germinales ex vivo e in vitro, la recapitulación de arquitecturas testiculares in vivo-miméticas (es decir, estructuras que se asemejan a túbulos seminíferos) con marcadores adicionales que sugieren la simulación de la fisiología testicular (por ejemplo, función endocrina), son hitos prioritarios hacia la generación de organoides que algún día podrían sostener espermatogénesis in vitro.

La mayoría de los métodos organoides testiculares publicados aprovechan el ECM disponible comercialmente (por ejemplo, formulaciones de colágeno o ECM patentadas)^25,26,27 o ECM de origen personalizado (es decir, testículos decelularizados hidrogeles derivados de ECM)^28,,29,30. El ECM exógeno promueve la formación de tejido de novo proporcionando un andamio de apoyo al ensamblaje para la generación de tejidos. Los métodos de ECM han dado un nivel impresionante de formación de tejidos, incluyendo cierta presencia de células germinales y morfología de los tejidos miméticos^25,,28. Sin embargo, los ECM que utilizan no siempre están disponibles universalmente (es decir, hidrogeles descelularizados derivados de ECM), y algunos métodos requieren sofisticadas orientaciones de siembra de gel y células (por ejemplo, gradientes de 3 capas de ECM e impresión 3D)^25,,31,,32. Los métodos libres de andamios (por ejemplo, gota colgante y placas de cultivo no adherentes)^33,34,35 también han generado organoides robustos y altamente reproducibles sin necesidad de geles ECM o andamios. Sin embargo, la morfología tisular de estos organoides libres de andamios es a menudo diferente a los testículos in vivo, y la mayoría de estos informes incorporan un aditivo ECM bioquímico para promover la formación de tejidos^33,,34,36, o alternativamente, dependen de la centrifugación para la agregación de células forzadas y la compactación^34,haciéndolos menos ideales para el estudio de la migración dirigida por células y la autoorganización.

Los cuatro métodos de generación de organoides presentados en este manuscrito incluyen estrategias tanto dependientes de ECM como estrategias independientes, cada una de las dos utilizando una simple siembra celular que permite la observación del autoensamble organoide impulsado por células. Las cuatro técnicas se pueden realizar desde las mismas suspensiones celulares o pueden hacer uso de poblaciones personalizadas y enriquecidas de tipo celular. Una fuerza de estos métodos es la capacidad de observar organoides autoensamblados en tiempo real, y comparar directamente cómo las estructuras testiculares se autoensamblan entre diferentes microambientes de cultivo. Las diferencias fenotípicas entre estos cuatro métodos de cultivo deben ser consideradas por su impacto en la cuestión de investigación o sujeto del investigador. Cada método produce construcciones biológicas u organoides dentro de 24 h o menos. En conclusión, los métodos presentados aquí proporcionan un conjunto de herramientas de técnicas de ensamblaje organoides para el estudio del ensamblaje organoide testicular, desarrollo de tejidos y fisiología testicular in vitro.