Дополнительные сотовые матрицы на основе и экстра сотовой матрицы свободного поколения Murine яичка органоидов

Органоиды яичек являются новаторской техникой для изучения развития яичек, сперматогенеза и^{физиологии в пробирке 1,,2,,3,,4.} Было изучено несколько методов для генерации органоидов; к ним относятся различные внеклеточные матричные (ЭКМ) и системы культуры, свободные от ЭКМ, как в двухмерных (2D), так и в трехмерных (3D) ориентациях. Различные методы генерации могут способствовать разработке различных стратегий клеточной сборки; это приводит к высокому уровню морфологической и функциональной изменчивости между опубликованными органоидными моделями. Цель этой статьи состоит в том, чтобы обсудить текущее состояние в пробирке тестикулярных моделей, и служить в качестве шаблона для будущих исследователей, при разработке яичек органоидных экспериментов. В рамках настоящего исследования в экспериментальном процессе и биологическом исходе определены и охарактеризованы четыре различных архетипа системы культуры. К ним относятся: 2D ECM-Free, 2D ECM, 3D ECM-Free и 3D ECM методы культуры. Представленные в настоящем деле стратегии призваны быть простыми, доступными и воспроизводимыми между различными лабораториями и исследовательскими группами.

Исторически для яичка, обозначение “in vitro”, был использован для нескольких различных методов культуры яичек тканей и клеток. К ним относятся органотипические ткани / орган культуры методы (т.е.^{эксплант культуры) 5}, изолированные семенной трубчатой^{культуры 6},^{яичек клеточной культуры 7}, и методы де Ново^тканиморфогенез (т.е., биологические конструкции и органоиды) 1 . Первые исследования в пробирке сперматогенез были проведены около 100 лет назад, с культурой кролика яичка explants в 1920⁸, а затем в 1937 году с мышью explants⁹. В рамках этих первоначальных экспериментов сперматозоиды наблюдались в значительной степени вырождаются в течение первой недели культуры, хотя некоторые мейотически дифференциации клеток были определены. Напоминая эти исторические отчеты, тестис explant культуры был возрожден и оптимизирован в 2011 году, чтобы стать возможным методом для изучения яичка¹⁰. С 2011 года, explant культуры производится плодородия компетентных спермы^{в нескольких докладах 11,12,13}. Тем не менее, из-за explant культуры зависимость от уже существующих местных труб яички, эти последние достижения более точно описаны как примеры “ex vivo” функции яичек и сперматогенез, функции тканей, которая была сохранена или возобновлена после удаления из организма организма. Несмотря на свою распространенность в литературе, долгосрочное поддержание зародышевых клеток и дифференциации в яичках explants является сложной^{задачей для репликации 14},^15,16,17,18, особенно в течение таймфреймов достаточно^долго,чтобы полностью наблюдать в пробирке сперматогенез (35^{дней у мышей 19} и 74 у людей²⁰). Это интригует, чтобы оценить, что многие из тех же проблем, с которыми сталкиваются 100 лет назад, все еще испытываются в ex vivo сперматогенез сегодня.

В отличается от подходов ex vivo, органоиды яичек de novo собраны микротызы, полностью генерируемые в пробирке из клеточных источников (т.е. первичных яичек). Тестикулярные органоиды обеспечивают творческую стратегию, чтобы обойти историческую зависимость поля от уже существующих местных тканей, и резюмировать биологии яичек полностью in vitro. Есть несколько требований, разделяемых большинством моделей органоидных тканей; к ним относятся (1) виво-миметическая морфология тканей или архитектура, (2) несколько основных типов клеток представленной ткани, (3) самосделки или самоорганизации в их поколении, и (4) способность имитировать некоторый уровень функции^{представленной ткани и физиологии 21,22,23,24}. Для яичка, это может быть захвачено в четырех основных признаков: (1) включение основных типов яичек клеток, зародыши, Сертоли, Лейдиг, перитубулярные и другие интерстициальные клетки, (2) клеточной сборки тканей, (3) надлежащим образом разобщенные типы клеток в отдельные трубчатые отсеки (зародыши и сертолии) и интерстициальные области (все другие типы клеток), и (4) некоторую степень функции тканей (например, секреция репродуктивных гормонов или тканей). Учитывая исторические проблемы в поддержании дифференциации зародышевых клеток ex vivo и in vitro, повторение виво-миметических архитектур яичек (т.е. структур, напоминающих семенные трубочки) с дополнительными маркерами, предполагающими моделирование физиологии яичек (например, эндокринная функция), являются приоритетными вехами в направлении генерации органоидов, которые в один прекрасный день могут выдержать в пробирке.

Большинство опубликованных методов органоидов яичка воспользоваться коммерчески доступны ECM (например, коллагена или собственной ECM формулировки)^25,26,27 или пользовательских источников ECMs (т.е. децеллюляризованных яичка ECM полученных гидрогели)^28,29,30. Экзогенный ECM способствует образованию тканей de novo путем предоставления сборочно-поддерживающего эшафота для генерации тканей. ECM методы позволили впечатляющий уровень формирования тканей, в том числе некоторые присутствия зародышевых клеток и ткани-мимететической^{морфологии 25,28}. Тем не менее, ECMs они используют не всегда универсально доступны (т.е., decellularized ECM полученных гидрогели), и некоторые методы требуют сложных гель и клеточных ориентаций посева (например, 3-слойные градиенты ECM и 3D-печати)^25,31,32. Методы, свободные от строительных лесов (например, висячие капли и неадъедерные пластины культуры)^33,,34,^{35 также}создали надежные и высоко воспроизводимые органоиды без необходимости ECM гелей или эшафотов. Тем не менее, морфология тканей этих эшафот-свободных органоидов часто отличается от in vivo яички, и большинство из этих докладов включают биохимические добавки ECM для^{содействия образованию тканей 33,34,36}, или в качестве альтернативы, полагаться на центрифугации для принудительной агрегации клеток и уплотнения³⁴, что делает их менее идеальными для изучения клеточной миграции и самоорганизации.

Четыре метода генерации органоидов, представленные в этой рукописи, включают как зависимые от ЭКМ, так и независимые стратегии, каждая из которых использует простое клеточное посевное, позволяющее осуществлять наблюдение за клеточной органоидной самосожжением. Все четыре метода могут быть выполнены из тех же подвесок клеток или могут использовать пользовательские и клеточного типа обогащенных популяций. Сила этих методов является способность наблюдать органоидов самостоятельно собираться в режиме реального времени, и непосредственно сравнить, как яичек структуры самостоятельной сборки между различными микроокноронами культуры. Фенотипические различия между этими четырьмя методами культуры должны быть рассмотрены для их воздействия на исследовательский вопрос или предмет следователя. Каждый метод производит биологические конструкции или органоиды в пределах 24 ч или менее. В заключение, методы, представленные здесь обеспечивают инструментарий органоидных методов сборки для изучения органоидной сборки яичек, развития тканей и физиологии яичек в пробирке.