Geração extra-baseada em matriz celular e extra-celular livre de organoides testiculares de murina

Organoides testiculares são uma técnica pioneira para estudar desenvolvimento testicular, espermatogênese e fisiologia in vitro^1,2,,3,4. Vários métodos têm sido explorados para a geração organoide; estes incluem uma variedade de sistemas de cultura extracelular (ECM) e sem ECM, tanto em orientações bidimensionais (2D) quanto tridimensionais (3D). Diferentes métodos de geração podem promover estratégias distintas de montagem celular; isso resulta em um alto nível de variabilidade morfológica e funcional entre modelos organoides publicados. O objetivo deste artigo é discutir o estado atual dos modelos testiculares in vitro, e servir de modelo para futuros pesquisadores, ao projetar experimentos organoides testiculares. No presente estudo, quatro arquétipos diferentes do sistema cultural são definidos e caracterizados em processo experimental e desfecho biológico. Estes incluem: métodos de cultura 2D ECM-Free, 2D ECM, 3D ECM-Free e 3D ECM. As estratégias aqui apresentadas destinam-se a ser simples, acessível e altamente reprodutível entre diferentes laboratórios e grupos de pesquisa.

Historicamente para os testis, a designação “in vitro”, tem sido usada para vários métodos culturais diferentes de tecidos e células testiculares. Estes incluem métodos organotípicos de tecido/cultura de órgãos (ou seja, cultura explant)⁵, cultura de túbulos seminiferos^{isolados 6,}cultura celular testicular⁷, e métodos de morfogênese de novo tecido (ou seja, construções biológicas e organoides)¹. As primeiras investigações sobre espermatogênese in vitro foram realizadas há aproximadamente 100 anos, com a cultura de explants de testígenos de coelho em 1920⁸, e mais tarde em 1937 com explants de camundongos⁹. Dentro desses experimentos iniciais, a espermatogonia foi observada para se degenerar em grande parte durante a primeira semana de cultura, embora algumas células meioticamente diferenciadas tenham sido identificadas. Lembrando esses relatos históricos, a cultura explant testis foi revivida e otimizada em 2011 para se tornar uma técnica viável para o estudo do testis¹⁰. Desde 2011, a cultura explant produz esperma competente em múltiplos relatórios^11,12,13. No entanto, devido à dependência da cultura explant em túbulos de testículos nativos pré-existentes, esses avanços recentes são descritos com mais precisão como exemplos de função testicular “ex vivo” e espermatogênese, função tecidual que foi mantida ou retomada após a remoção do corpo de um organismo. Apesar de sua prevalência na literatura, a manutenção de células germinativas de longo prazo e a diferenciação dentro de explants testiculares são desafiadoras para replicar^{14,15,16,17,18}, especialmente em períodos longos o suficiente para observar totalmente a espermatogênese in vitro (~35 dias em camundongos¹⁹ e 74 em humanos²⁰). É intrigante perceber que muitos dos mesmos desafios experimentados há 100 anos, ainda são experimentados dentro da espermatogênese ex vivo hoje.

Diferente das abordagens ex vivo, os organoides testiculares são microtissues montados de novo gerados inteiramente in vitro a partir de fontes celulares (ou seja, células testiculares primárias). Organoides testiculares fornecem uma estratégia criativa para contornar a dependência histórica do campo sobre o tecido nativo pré-existente, e para recapitular a biologia testicular completamente in vitro. Existem múltiplos requisitos compartilhados pela maioria dos modelos de tecido organoide; estes incluem (1) morfologia ou arquitetura de tecido simicoético vivo, (2) múltiplos tipos de células principais do tecido representado, (3) auto-montagem ou auto-organização em sua geração, e (4) a capacidade de simular algum nível da função e fisiologia do tecido representado^{21,,22,,23,,24}. Para os testis, isso pode ser capturado em quatro grandes marcas: (1) a inclusão de grandes tipos de células testiculares, germe, Sertoli, Leydig, peritubular, e outras células intersticiais, (2) conjunto de tecidos direcionados por células, (3) tipos de células compartimentadas apropriadamente em compartimentos tubulares separados (germe e Sertoli) e regiões intersticiais (todos os outros tipos de células), e (4) algum grau de função tecidual (por exemplo, secreção hormonal reprodutiva ou respostas teciduais, germe e manutenção celular e diferenciação). Considerando os desafios históricos na manutenção da diferenciação de células germinativas ex vivo e in vitro, a recapitulação de arquiteturas testiculares intramicéticas (ou seja, estruturas semelhantes a túbulos seminiferos) com marcadores adicionais sugerindo simulação de fisiologia testicular (por exemplo, função endócrina), são marcos prioritários para a geração de organoides que podem um dia sustentar na espergenena.

A maioria dos métodos organoides testiculares publicados aproveitam as formulações de ECM disponíveis comercialmente (por exemplo, colágeno ou ecm proprietário)^25,,26,27 ou ECMs de origem personalizada (ou seja, testis descelularizados)^28,,29,,30. O ECM exógeno promove a formação de tecidos de novo através do fornecimento de um andaime de suporte à montagem para a geração de tecidos. Os métodos de ECM têm proporcionado um nível impressionante de formação tecidual, incluindo alguma presença de células germinativas e morfologia mímica tecidual^25,,28. No entanto, os ECMs que utilizam nem sempre estão disponíveis universalmente (ou seja, hidrogéis derivados do ECM), e alguns métodos requerem orientações sofisticadas de gel e semeadura celular (por exemplo, gradientes de 3 camadas de ECM e impressão 3D)^25,,31,,32. Métodos livres de andaimes (por exemplo, gota suspensa e placas de cultura não adesê),^33,,34,35 também geraram organoides robustos e altamente reprodutíveis sem a necessidade de géis ECM ou andaimes. No entanto, a morfologia tecidual desses organoides livres de andaimes é muitas vezes diferente dos testículos in vivo, e a maioria desses relatórios incorpora um aditivo bioquímico de ECM para promover a formação de tecidos^33,,34,,36ou, alternativamente, dependem de centrifugação para agregação celular forçada e compactação³⁴, tornando-os menos ideais para estudar migração e auto-organização dirigidas por células.

Os quatro métodos de geração organoide apresentados neste manuscrito incluem estratégias dependentes do ECM e independentes, cada uma utilizando semeadura celular simples que permite a observação da automontagem organoide orientada por células. Todas as quatro técnicas podem ser realizadas a partir das mesmas suspensões celulares ou podem fazer uso de populações personalizadas e enriquecidas do tipo celular. Uma força desses métodos é a capacidade de observar organoides auto-montados em tempo real, e comparar diretamente como estruturas testiculares se auto-reúnem entre diferentes microambientes culturais. As diferenças fenotípicas entre esses quatro métodos culturais devem ser consideradas por seu impacto na questão da pesquisa ou assunto do pesquisador. Cada método produz construções biológicas ou organoides dentro de 24 h ou menos. Em conclusão, os métodos aqui apresentados fornecem um kit de ferramentas de técnicas de montagem organoide para o estudo do montagem organoide testicular, desenvolvimento de tecidos e fisiologia testicular in vitro.