細胞外マトリックスベースおよび細胞外マトリックスフリーのマウス精巣オルガノイドの生成

精巣オルガノイドは、精巣の発達、精子形成、および生理学をvitro^{11、2、3、42,3,4}で研究するための先駆的な技術である。オルガノイド生成のためにいくつかの方法が検討されている。これらには、2次元(2D)および3次元(3D)の向きの両方で、さまざまな細胞外マトリックス(ECM)およびECMフリー培養系が含まれる。異なる生成方法は、明確なセルラーアセンブリ戦略を促進することができます;これにより、公開されたオルガノイドモデル間の形態学的および機能的変動の高いレベルが生じる。この記事の目的は、精巣の器官化実験を設計する際に、体外精巣モデルの現状を議論し、将来の研究者のためのテンプレートとして機能することです。本研究では、4つの異なる培養系のアーキタイプが、実験過程および生物学的結果において定義され、特徴付けられる。これらには、2D ECM フリー、2D ECM、3D ECM フリー、および 3D ECM カルチャメソッドが含まれます。本書に示す戦略は、異なる研究所と研究グループ間で、シンプルでアクセスしやすく、再現性の高い戦略です。

歴史的に精巣のために、「in vitro」という指定は、精巣組織および細胞のいくつかの異なる培養方法のために使用されてきた。これらには、組織/臓器培養方法(すなわち、外植培養^)5、単離された半細管培養^6、精巣細胞培養^7、およびデノボ組織形態形成(すなわち、生物学的構造およびオルガノイ^ド)の方法が含まれる。体外精子形成の最初の調査は約100年前に行われ、ウサギの精巣の培養は1920⁸年に、そして1937年にはマウスの外植体⁹で外植した。これらの最初の実験の中で、精子は培養の最初の週に大部分が退化することが観察されたが、いくつかのmeiottって分化する細胞が同定された。これらの歴史的な報告を連想させる、精巣培養は2011年に復活し、精巣¹⁰を研究するための実現可能な技術になるために最適化された。2011年以来、外植培養は^{、複数のレポート11、12、13,12}で不妊治療の有能な精子^を13産生している。しかし、外植培養が既存の在来精巣細管に依存しているため、これらの最近の進歩は、生物の体内からの除去時に維持または再開された組織機能である「ex vivo」精巣機能および精子形成の例としてより正確に記述されている。文献におけるその有病率にもかかわらず、精巣外植物内の長期生殖細胞維持および分化は、特に体外精子形成で完全に観察するのに十分な長さの時間枠にわたって^{14、15、16、17、18,15,16,17,18}を複製することは困難である(ヒトでは¹⁹および74のマウスでは35^日)。100年前に経験した同じ課題の多くが、今日でもex vivo精子形成の中で経験されていることを理解することは興味深いです。

ex vivoアプローチとは異なり、精巣オルガノイドは、細胞源(すなわち、一次精巣細胞)から完全にインビトロで生成されたデノボ組み立てられたマイクロ組織である。精巣オルガノイドは、既存のネイティブ組織に対するフィールドの歴史的依存を回避し、精巣生物学を完全にインビトロで再現するための創造的な戦略を提供します。ほとんどのオルガノイド組織モデルで共有される複数の要件があります。これらは、(1)生体擬態組織形態またはアーキテクチャにおいて、(2)代表組織の複数の主要な細胞型、(3)その生成における自己集合または自己組織化、および(4)表される組織の機能および生理学^{21、22、23、2422}の一²¹定レベルをシミュレートする能力を含む。^,23,24精巣の場合、これは4つの主要な特徴で捉えることができます:(1)主要な精巣細胞タイプを含む、 胚芽、セルトリ、ライディグ、骨膜、および他の間質細胞、(2)細胞指向組織アセンブリ、(3)適切に区分された細胞型を別々の管状コンパートメント(胚芽およびセルトリ)および間質領域(他のすべての細胞型)、および(4)ある程度の組織機能(例えば、生殖ホルモン分泌または生殖組織応答)および異なる細胞の応答を含む。生殖細胞分化ex vivoおよびin vitroを維持する際の歴史的課題を考慮すると、精巣生理学のシミュレーション(例えば、内分泌)機能を生成することを示唆する追加マーカーを用いた生体内模倣精巣精巣アーキテクチャ(すなわち、半細管に似た構造)の再現は、1日の精子で生殖機能を持続する臓器組織の生成に向けた優先的なマイルストーンである。

公示された精巣オルガノイド法の大部分は、市販のECM(例えば、コラーゲンまたは独自のECM製剤^{)25、26、27,26,27}またはカスタム供給ECM(すなわち、脱細胞化精巣ECM由来ヒドロゲル^{)28、29、30,29,30}を利用する。外因性ECMは、組織生成のための組み立て支持足場を提供することにより、デノボ組織形成を促進する。ECMの方法は、いくつかの生殖細胞の存在と組織模倣形態^25、28を含む組織形成の印象的なレベル^を28与えている。しかし、彼らが利用するECMは、常に普遍的に入手可能であるとは限らず(すなわち、脱細胞化されたECM由来ヒドロゲル)、そしていくつかの方法は洗練されたゲルおよび細胞の播種の向き(例えば、ECMおよび3D印刷の3層の勾配^{)25、31、3231,32}を必要とする。²⁵足場を含まない方法(例えば、ハンギングドロップおよび非接着培養プレート)33、34、35はまた、ECMゲルまたは足場を必要とせずに堅牢で再現性の高いオルガノイドを生成した。^33,34,35しかし、これらの足場を含まないオルガノイドの組織形態は、生体内精巣と異なることが多く、これらの報告のほとんどは、組織形成を促進するために生化学的ECM添加剤を組み込み^{、33、34、36、34,36}または代わりに、強制細胞凝集および圧縮³⁴のための遠心分離に依存し、細胞指向移動および自己組織化を研究するのに理想的ではない。³³

本稿で紹介する4つのオルガノイド生成法には、ECM依存性と独立した戦略の両方が含まれ、それぞれが細胞駆動型オルガノイド自己集合の観察を可能にする単純な細胞播種を用いる。4 つの手法はすべて、同じセルの中断から実行することも、カスタムおよびセル型の濃縮された集団を利用することもできます。これらの方法の強みは、オルガノイドをリアルタイムで自己集合的に観察し、精巣構造が異なる培養マイクロ環境間でどのように自己集合するかを直接比較する能力である。これら4つの培養方法の間の語体的な違いは、研究者の研究課題または主題に与える影響について考慮されるべきである。各方法は、24時間以下の生物学的構築物またはオルガノイドを生成する。結論として、ここで提示される方法は、精巣オルガノイドアセンブリ、組織の発達、および精巣生理学を試験的に研究するためのオルガノイド組立技術のツールキットを提供する。