Generazione extra di organoidi testicolari murini basati su matrice cellulare ed extra cellulare

Gli organoidi testicolari sono una tecnica pionieristica per lo studio dello sviluppo testicolare, della spermatogenesi e della fisiologia in vitro^1,,2,,3,,4. Diversi metodi sono stati esplorati per la generazione organoide; questi includono una varietà di sistemi di coltura extracellulari (ECM) e senza ECM, sia negli orientamenti bidimensionali (2D) che tridimensionali (3D). Diversi metodi di generazione possono promuovere strategie di assemblaggio cellulare distinte; ciò si traduce in un alto livello di variabilità morfologica e funzionale tra i modelli organoidi pubblicati. Lo scopo di questo articolo è discutere lo stato attuale dei modelli testicolari in vitro e servire da modello per i futuri ricercatori, quando si progettano esperimenti organoidi testicolari. All’interno del presente studio, quattro diversi archetipi del sistema di coltura sono definiti e caratterizzati in processo sperimentale e risultato biologico. Questi includono: metodi di coltura 2D ECM-Free, 2D ECM, 3D ECM-Free e 3D ECM. Le strategie qui presentate sono destinate ad essere semplici, accessibili e altamente riproducibili tra diversi laboratori e gruppi di ricerca.

Storicamente per il testicolo, la designazione “in vitro”, è stata utilizzata per diversi metodi di coltura di tessuti e cellule testicolari. Questi includono metodi di^colturaorganotipico di tessuti/organi (cioè coltura di espianto) 5 , coltura isolata di tubuli seminiferi^6,coltura cellulare testicolare⁷e metodi di morfogenesi dei tessuti de novo (cioè costrutti biologici e organoidi)¹. Le prime ricerche sulla spermatogenesi in vitro sono state eseguite circa 100 anni fa, con la coltura di espianto di testicoli di coniglio nel 1920⁸e successivamente nel 1937 con espianto di topi⁹. All’interno di questi esperimenti iniziali la spermatogonia è stata osservata degenerare in gran parte durante la prima settimana di coltura, sebbene siano state identificate alcune cellule meioticamente differenzianti. Ricordando questi rapporti storici, la cultura dell’espianto del testicolo è stata ripresa e ottimizzata nel 2011 per diventare una tecnica fattibile per lo studio del testicolo¹⁰. Dal 2011, la coltura di espianto ha prodotto sperma competente per la fertilità in più^{rapporti11,12,,13}. Tuttavia, a causa della dipendenza della coltura di espianto dai tubuli dei testicoli nativi preesistenziati, questi recenti progressi sono descritti più accuratamente come esempi di funzione testicolare “ex vivo” e spermatogenesi, funzione tissutale che è stata mantenuta o ripresa al momento della rimozione dal corpo di un organismo. Nonostante la sua prevalenza in letteratura, il mantenimento e la differenziazione a lungo termine delle cellule germinali all’interno delle espianto^,testicolari è difficile da replicare^14,,15,16,17^,18, specialmente in tempi abbastanza lunghi da osservare pienamente la spermatogenesi in vitro (~ 35 giorni nei^{topi 19} e 74 nell’uomo²⁰).¹⁵ È intrigante apprezzare che molte delle stesse sfide vissute 100 anni fa, sono ancora oggi vissute all’interno della spermatogenesi ex vivo.

Diversi dagli approcci ex vivo, gli organoidi testicolari sono microtissue assemblate de novo generate interamente in vitro da fonti cellulari (cioè cellule testicolari primarie). Gli organoidi testicolari forniscono una strategia creativa per aggirare la dipendenza storica del campo dal tessuto nativo preesiste e per ricapitolare la biologia testicolare completamente in vitro. Ci sono più requisiti condivisi dalla maggior parte dei modelli di tessuto organoide; questi includono (1) morfologia o architettura del tessuto in vivo-mimetico, (2) più tipi di cellule principali del tessuto rappresentato, (3) auto-assemblaggio o auto-organizzazione nella loro generazione e (4) la capacità di simulare un certo livello della funzione e della fisiologia del tessuto rappresentato^21,22,23,24. Per il testicolo, questo può essere catturato in quattro segni distintivi principali: (1) l’inclusione dei principali tipi di cellule testicolari, germe, Sertoli, Leydig, cellule peritubulari e altre cellule interstiziali, (2) assemblaggio di tessuti diretti a cellule, (3) tipi di cellule opportunamente compartimentate in compartimenti tubolari separati (germe e Sertoli) e regioni interstiziali (tutti gli altri tipi di cellule) e (4) un certo grado di funzione tissutale (ad esempio, secrezione o risposte dei tessuti dell’ormone riproduttivo, mantenimento e differenziazione delle cellule germinali). Considerando le sfide storiche nel mantenimento della differenziazione delle cellule germinali ex vivo e in vitro, la ricapitolazione di architetture testicolari in vivo-mimetiche (cioè strutture simili a tubuli seminiferi) con marcatori aggiuntivi che suggeriscono la simulazione della fisiologia testicolare (ad esempio, la funzione endocrina), sono pietre miliari prioritarie verso la generazione di organoidi che un giorno potrebbero sostenere la spermatogenesi in vitro.

La maggior parte dei metodi organoidi testicolari pubblicati sfrutta l’ECM disponibile in commercio (ad esempio, collagene o formulazioni ECM proprietarie)^25,26,,27 o ECM di origine personalizzata (ad esempio, idrogel decellularizzati derivati da testis ECM)^28,29,30. L’ECM esogeno promuove la formazione di tessuti de novo fornendo un’impalcatura di supporto all’assemblaggio per la generazione di tessuti. I metodi ECM hanno offerto un livello impressionante di formazione dei tessuti, tra cui una certa presenza di cellule germinali e morfologia tessuto-mimetica^25,,28. Tuttavia, gli EMM che utilizzano non sono sempre universalmente disponibili (ad esempio, idrogel decellularizzati derivati da ECM) e alcuni metodi richiedono sofisticati orientamenti di semina in gel e cellule (ad esempio, gradienti a 3 strati di ECM e stampa 3D)^25,,31,32. I metodi senza impalcature (ad esempio, caduta sospesa e piastre di coltura non aderenti)^33,34,35 hanno anche generato organoidi robusti e altamente riproducibili senza la necessità di gel O impalcature ECM. Tuttavia, la morfologia tissutale di questi organoidi senza impalcature è spesso dissimile dai testi in vivo, e la maggior parte di questi rapporti incorpora un additivo biochimico ECM per promuovere la^{formazione dei tessuti 33,34,36}o, in alternativa, fare affidamento sulla centrifugazione per l’aggregazione forzata delle cellule e la^{compattazione 34,}rendendoli meno ideali per studiare la migrazione e l’auto-organizzazione dirette dalle cellule.

I quattro metodi di generazione organoide presentati in questo manoscritto includono sia strategie dipendenti dall’ECM che strategie indipendenti, ognuna delle quali utilizza una semplice semina cellulare che consente l’osservazione dell’auto-assemblaggio organoide guidato dalle cellule. Tutte e quattro le tecniche possono essere eseguite dalle stesse sospensioni cellulari o possono utilizzare popolazioni arricchite personalizzate e di tipo cellulare. Un punto di forza di questi metodi è la capacità di osservare gli organoidi auto-assemblarsi in tempo reale e di confrontare direttamente come le strutture testicolari si auto-assemblano tra diversi microambientati di coltura. Le differenze fenotipiche tra questi quattro metodi di coltura dovrebbero essere prese in considerazione per il loro impatto sulla questione della ricerca o sull’oggetto dello sperimentatore. Ogni metodo produce costrutti biologici o organoidi entro 24 ore o meno. In conclusione, i metodi qui presentati forniscono un toolkit di tecniche di assemblaggio organoide per lo studio dell’assemblaggio organoide testicolare, dello sviluppo tissutale e della fisiologia testicolare in vitro.