Extra Cellular Matrix-Based and Extra Cellular Matrix-Free Generation of Murine Testicular Organoids

Organoïdes testiculaires sont une technique pionnière pour étudier le développement testiculaire, spermatogenèse, et la physiologie in vitro^1,2,3,4. Plusieurs méthodes ont été explorées pour la génération organoïde; il s’agit notamment d’une variété de systèmes de culture extracellulaire (ECM) et sans ECM, dans les deux dimensions (2D) et en trois dimensions (3D) orientations. Différentes méthodes de génération peuvent promouvoir des stratégies d’assemblage cellulaire distinctes; il en résulte un niveau élevé de variabilité morphologique et fonctionnelle entre les modèles organoïdes publiés. Le but de cet article est de discuter de l’état actuel des modèles testiculaires in vitro, et de servir de modèle pour les futurs chercheurs, lors de la conception d’expériences organoïdes testiculaires. Dans la présente étude, quatre archétypes différents du système culturel sont définis et caractérisés dans le processus expérimental et les résultats biologiques. Il s’agit notamment de: 2D ECM-Free, 2D ECM, 3D ECM-Free, et 3D ECM méthodes de culture. Les stratégies présentées ici se veulent simples, accessibles et hautement reproductibles entre différents laboratoires et groupes de recherche.

Historiquement pour les testicules, la désignation « in vitro », a été utilisée pour plusieurs méthodes de culture différentes de tissus et de cellules testiculaires. Il s’agit notamment des méthodes organotypiques de culture des tissus et des organes (c.-à-d. la culture des explantations)^5,de la culture isolée des tubules séminifères^6,de la culture cellulaire testiculaire⁷et des méthodes de morphogenèse des tissus de novo (c.-à-d. constructions biologiques et organoïdes)¹. Les premières investigations sur la spermatogenèse in vitro ont été réalisées il y a environ 100 ans, avec la culture des explants de testicules de lapin en 1920^8,et plus tard en 1937 avec des explants de souris⁹. Dans ces expériences initiales spermatogonia ont été observés pour dégénérer en grande partie au cours de la première semaine de culture, bien que certaines cellules meiotically différenciation ont été identifiés. Rappelant ces rapports historiques, la culture d’explantation de testis a été relancée et optimisée en 2011 pour devenir une technique réalisable pour étudier le testis¹⁰. Depuis 2011, la culture d’explant a produit le sperme compétent de fertilité dans les rapports^{multiples 11,,12,,13.} Pourtant, en raison de la dépendance de la culture d’explantation sur les tubules indigènes préexistants de testicule, ces avances récentes sont plus exactement décrites comme exemples de fonction testiculaire « ex vivo » et de spermatogenèse, fonction tissulaire qui a été maintenue ou reprise lors de l’enlèvement du corps d’un organisme. En dépit de sa prédominance dans la littérature, le maintien et la différenciation à long terme de cellules germinales dans les explants testiculaires est difficile^{de reproduire 14,,15,,16,,17,,18,}particulièrement au-dessus des périodes assez longues pour observer entièrement la spermatogenèse in vitro (~35 jours chez les^{souris 19} et 74 chez l’homme^20). Il est fascinant d’apprécier que bon nombre des mêmes défis rencontrés il ya 100 ans, sont encore expérimentés dans ex vivo spermatogenesis aujourd’hui.

Différents des approches ex vivo, les organoïdes testiculaires sont des microtissues assemblés de novo générés entièrement in vitro à partir de sources cellulaires (c.-à-d. cellules testiculaires primaires). Les organoïdes testiculaires fournissent une stratégie créative pour contourner la dépendance historique du champ à l’égard des tissus indigènes préexistants, et pour récapituler la biologie testiculaire complètement in vitro. Il existe de multiples exigences partagées par la plupart des modèles de tissus organoïdes; il s’agit notamment (1) de morphologie ou d’architecture des tissus in vivo-mimétiques, (2) de multiples types cellulaires majeurs du tissu représenté, (3) d’auto-assemblage ou d’auto-organisation dans leur génération, et (4) la capacité de simuler un certain niveau de la fonction et de la physiologie du tissu^{représenté 21,22,23,24}. Pour les testicules, cela peut être capturé en quatre grandes caractéristiques : (1) l’inclusion de principaux types de cellules testiculaires, germe, Sertoli, Leydig, cellules péritubulaires et autres cellules interstitielles, (2) assemblage de tissus dirigés par cellules, (3) types de cellules compartimentées de façon appropriée dans des compartiments tubulaires distincts (germe et Sertoli) et régions interstitielles (tous les autres types de cellules), et (4) un certain degré de fonction tissulaire (p. ex., sécrétion d’hormones reproductrices ou réponses tissulaires, et maintien et différenciation des cellules germinales). Compte tenu des défis historiques liés au maintien de la différenciation des cellules germinales ex vivo et in vitro, la récapitulation d’architectures testiculaires in vivo-mimétiques (c.-à-d. structures ressemblant à des tubules séminifères) avec des marqueurs supplémentaires suggérant la simulation de la physiologie testiculaire (p. ex., fonction endocrinienne), sont des étapes prioritaires vers la génération d’organoïdes qui pourraient un jour soutenir la spermatogenèse in vitro.

La majorité des méthodes organoïdes testiculaires publiées profitent de l’ECM disponible dans le commerce (p. ex., collagène ou formulations brevetées d’ECM)^25,26,27 ou des ECM sur mesure (c.-à-d. hydrogels dérivés de testis décellularisés)^28,29,30. L’ECM exogène favorise la formation de tissus de novo en fournissant un échafaudage de soutien à l’assemblage pour la génération de tissus. Les méthodes d’ECM ont offert un niveau impressionnant de formation de tissu, y compris une certaine présence de cellules germinales et la morphologie tissu-mimétique^25,28. Toutefois, les ECM qu’ils utilisent ne sont pas toujours universellement disponibles (c.-à-d. hydrogels dérivés de l’ECM décellularisés), et certaines méthodes nécessitent des orientations sophistiquées en gel et en semis cellulaires (p. ex., gradients de 3 couches d’ECM et d’impression 3D)^25,31,32. Les méthodes sans échafaudage (p. ex., chute suspendue et plaques de culture non hémorentes)^33,34,^{35 ont}également généré des organoïdes robustes et hautement reproductibles sans avoir besoin de gels ecm ou d’échafaudages. Cependant, la morphologie tissulaire de ces organoïdes sans échafaudage est souvent différente des testicules in vivo, et la plupart de ces rapports intègrent un additif biochimique ecm pour promouvoir la formation^{des tissus 33,34,36}, ou alternativement, compter sur la centrifugation pour l’agrégation cellulaire forcée et le compactage³⁴, ce qui les rend moins idéal pour étudier la migration dirigée par cellules et l’auto-organisation.

Les quatre méthodes de génération organoïde présentées dans ce manuscrit comprennent à la fois des stratégies dépendantes de l’ECM et des stratégies indépendantes, chacune utilisant un ensemencement cellulaire simple qui permet l’observation de l’auto-assemblage organoïde conduit par cellules. Les quatre techniques peuvent être exécutées à partir des mêmes suspensions cellulaires ou peuvent faire usage de populations enrichies personnalisées et de type cellulaire. Une force de ces méthodes est la capacité d’observer les organoïdes s’auto-assembler en temps réel, et de comparer directement comment les structures testiculaires s’auto-assemblent entre différents microenvironnements de culture. Les différences phénotypiques entre ces quatre méthodes culturelles devraient être prises en considération pour leur impact sur la question de recherche ou le sujet de l’investigateur. Chaque méthode produit des constructions biologiques ou organoïdes dans les 24 h ou moins. En conclusion, les méthodes présentées ici fournissent une boîte à outils des techniques d’assemblage organoïde pour étudier l’assemblage organoïde testiculaire, le développement tissulaire, et la physiologie testiculaire in vitro.