Extra Cellular Matrix-based en extra cellular matrix-vrije generatie van Murine Testiculaire Organoïden

Testiculaire organoïden zijn een baanbrekende techniek voor het bestuderen van testiculaire ontwikkeling, spermatogenese en fysiologie in vitro^1,2,3,4. Verschillende methoden zijn onderzocht voor organoïde generatie; deze omvatten een verscheidenheid aan extracellulaire matrix (ECM) en ECM-vrije kweeksystemen, zowel in tweedimensionale (2D) als in driedimensionale (3D) oriëntaties. Verschillende generatiemethoden kunnen verschillende cellulaire assemblagestrategieën bevorderen; dit resulteert in een hoge mate van morfologische en functionele variabiliteit tussen gepubliceerde organoïde modellen. Het doel van dit artikel is om de huidige toestand van in vitro testiculaire modellen te bespreken, en om te dienen als een sjabloon voor toekomstige onderzoekers, bij het ontwerpen van testiculaire organoïde experimenten. Binnen deze studie worden vier verschillende cultuursysteemarchetypen gedefinieerd en gekenmerkt in experimenteel proces en biologische uitkomst. Deze omvatten: 2D ECM-Free, 2D ECM, 3D ECM-Free en 3D ECM cultuurmethoden. De hierin gepresenteerde strategieën zijn bedoeld om eenvoudig, toegankelijk en zeer reproduceerbaar te zijn tussen verschillende laboratoria en onderzoeksgroepen.

Historisch voor de testis, de benaming “in vitro”, is gebruikt voor verschillende cultuurmethoden van testiculaire weefsels en cellen. Deze omvatten organotypische weefsel/orgaankweekmethoden (d.w.z. explantcultuur)⁵, geïsoleerde halfnifereuze tubulicultuur⁶, testiculaire celkweek⁷, en methoden van de novo weefselmorfogenese (d.w.z., biologische constructies en organoïden)¹. De eerste onderzoeken naar in vitro spermatogenese werden ongeveer 100 jaar geleden uitgevoerd, met de cultuur van konijn testis explants in 1920⁸, en later in 1937 met muis explants⁹. Binnen deze eerste experimenten spermatogonia werden waargenomen om grotendeels te degenereren in de eerste week van de cultuur, hoewel sommige meiotically differentiërende cellen werden geïdentificeerd. Doet denken aan deze historische rapporten, testis explant cultuur werd nieuw leven ingeblazen en geoptimaliseerd in 2011 om een haalbare techniek voor het bestuderen van de testis¹⁰. Sinds 2011 produceert de explantcultuur vruchtbaarheidsge competent sperma in meerdere rapporten^11,12,13. Toch, als gevolg van explant cultuur afhankelijkheid van reeds bestaande inheemse testis tubuli, deze recente vooruitgang worden nauwkeuriger beschreven als voorbeelden van “ex vivo” testiculaire functie en spermatogenese, weefsel functie die werd gehandhaafd of hervat bij verwijdering uit het lichaam van een organisme. Ondanks de prevalentie in de literatuur, lange termijn kiemcel onderhoud en differentiatie binnen testiculaire explants is een uitdaging om te repliceren^{14,15,16,17,18}, vooral over termijnen lang genoeg om volledig te observeren in vitro spermatogenese (~ 35 dagen bij muizen¹⁹ en 74 bij de mens²⁰). Het is intrigerend om te begrijpen dat veel van dezelfde uitdagingen ervaren 100 jaar geleden, zijn nog steeds ervaren binnen ex vivo spermatogenese vandaag.

Anders dan ex vivo benaderingen, testiculaire organoïden zijn de novo geassembleerde microtissues die volledig in vitro worden gegenereerd uit cellulaire bronnen (d.w.z. primaire testiculaire cellen). Testiculaire organoïden bieden een creatieve strategie om de historische afhankelijkheid van het veld van reeds bestaand inheems weefsel te omzeilen en testiculaire biologie volledig in vitro samen te vatten. Er zijn meerdere eisen gedeeld door de meeste organoïde weefselmodellen; deze omvatten (1) in vivo-mimetische weefselmorfologie of architectuur, (2) meerdere belangrijke celtypen van het vertegenwoordigde weefsel, (3) zelfassemblage of zelforganisatie in hun generatie, en (4) de mogelijkheid om een bepaald niveau van de functie en fysiologie van het vertegenwoordigde weefsel te simuleren^21,22,23,24. Voor de testis kan dit worden vastgelegd in vier belangrijke kenmerken: (1) de opname van belangrijke soorten testiculaire cellen, kiem,Sertoli, Leydig, peritubulaire, en andere interstitiële cellen, (2) cel-gerichte weefsel assemblage, (3) adequaat gecompartimenteerde celtypen in afzonderlijke buisvormige compartimenten (kiem en Sertoli) en interstitiële gebieden (alle andere celtypes), en (4) een zekere mate van weefselfunctie (bijvoorbeeld, reproductieve hormoon secretie of weefselreacties, en kiemcel onderhoud en differentiatie). Gezien de historische uitdagingen bij het handhaven van kiemceldifferentiatie ex vivo en in vitro, zijn de recapitulatie van in vivo-mimetische testiculaire architecturen (d.w.z. structuren die lijken op seminiferous tubuli) met extra markers die simulatie van testiculaire fysiologie suggereren (bijvoorbeeld endocriene functie), prioritaire mijlpalen zijn ten aanzien van het genereren van organoïden die op een dag in vitro spermatogenese zouden kunnen ondersteunen.

De meeste gepubliceerde testiculaire organoïde methoden maken gebruik van commercieel beschikbare ECM (bv. collageen of gepatenteerde ECM-formuleringen)^25,26,27 of op maat gemaakte ECU’s (d.w.z. gedecelluleerde testis ECM-afgeleide hydrogels)^28,29,30. Exogene ECM bevordert de novo weefselvorming door het verstrekken van een assemblage-ondersteunende steiger voor weefsel generatie. ECM-methoden hebben een indrukwekkend niveau van weefselvorming geboden, waaronder enige aanwezigheid van kiemcelcellen en weefselmimetische morfologie^25,28. De ECM’s die zij gebruiken zijn echter niet altijd universeel beschikbaar (d.w.z. gedecelluleerde ECM-afgeleide hydrogels) en sommige methoden vereisen geavanceerde gel- en celzaaioriëntaties (bijvoorbeeld 3-laaggradiënten van ECM en 3D-printen)^25,31,32. Steigervrije methoden (bijvoorbeeld hangende val en niet-loodzhemende kweekplaten)^33,34,35 hebben ook robuuste en zeer reproduceerbare organoïden gegenereerd zonder de noodzaak van ECM-gels of steigers. De weefselmorfologie van deze steigervrije organoïden is echter vaak ongelijk aan in vivo teelballen, en de meeste van deze rapporten bevatten een biochemisch ECM-additief ter bevordering van weefselvorming^33,34,36, of als alternatief, vertrouwen op centrifugatie voor geforceerde celaggregatie en verdichting³⁴, waardoor ze minder ideaal zijn voor het bestuderen van celgestuurde migratie en zelforganisatie.

De vier organoïde generatie methoden gepresenteerd in dit manuscript omvatten zowel ECM-afhankelijke en onafhankelijke strategieën, elk met behulp van eenvoudige cel zaaien die de observatie van cel-gedreven organoïde zelfassemblage mogelijk maakt. Alle vier de technieken kunnen worden uitgevoerd vanuit dezelfde cel suspensies of kan gebruik maken van aangepaste en cel-type verrijkte populaties. Een kracht van deze methoden is het vermogen om organoïden zelf te assembleren in real-time te observeren, en om direct te vergelijken hoe testiculaire structuren zelf assembleren tussen verschillende cultuurmicro-omgevingen. De fenotypische verschillen tussen deze vier cultuurmethoden moeten worden overwogen voor hun impact op de onderzoeksvraag of het onderwerp van de onderzoeker. Elke methode produceert biologische constructies of organoïden binnen 24 uur of minder. Tot slot, de hier gepresenteerde methoden bieden een toolkit van organoïde assemblagetechnieken voor het bestuderen van testiculaire organoïde assemblage, weefselontwikkeling en testiculaire fysiologie in vitro.