インタクトな機能的な膜タンパク質へのヌクレオチド結合をリアルタイムで測定

1.カバースリップの準備 注意: これらの手順は、滅菌済みの組織培養フード内で行う必要があります。量は10皿の準備のために与えられます。 オートクレーブ処理した30 mmホウケイ酸カバーガラス10枚を35 mm未処理の滅菌皿10個に個別に入れ、2 mLの滅菌蒸留水で1回すすぎます。 1 mL の 0.1% w/v ポリ-L-リジン溶液を滅菌蒸留水に希釈して、総容量を 10 mL にします (最終濃度 0.01% w/v)。よく混合し、各カバースリップに1 mLをピペットで入れ、室温で20分間インキュベートします。 ポリ-L-リジンを吸引し、各カバースリップを少なくとも2 mLの滅菌蒸留水で2回洗浄します。完全に乾くまで、つまり少なくとも3時間放置します。 2. HEK-293T細胞の播種 注意: これらの手順は、組織培養フード内で行う必要があります。HEK-293T細胞は、その低電流バックグラウンドおよび培養中の増殖の容易さのために選択された。このプロトコルは、他の細胞型に適合させることができる。 HEK-293T細胞の80〜90%コンフルエントT75フラスコを12 mLリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で1回すすぎ、2 mLトリプシンと2〜5分間インキュベートするか、細胞が完全に剥離してほぼ完全に解離するまでインキュベートします。 10%ウシ胎児血清、100 U / mLペニシリン、および100 μg/mLストレプトマイシンを添加した10 mLのダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)を加えて細胞を再懸濁します。フラスコの底を静かにピペットで固定して、残りの細胞の塊を分解します。 コーティングされたカバースリップを含む所望の数の35 mmディッシュに2 mLの添加DMEMを加えます。各ディッシュに100 μLの再懸濁細胞を加えます。37°Cで一晩インキュベートします。 3. トランスフェクション 注意: これらの手順は、組織培養フード内で行う必要があります。10皿のトランスフェクションのための量が与えられます。部位特異的なANAPを組み込むためには、標識を意図した位置のDNAコドンをアンバー(TAG)終止コドンで置換しなければならない。このコンストラクトは、2つのプラスミド、pANAPおよびpeRF1-E55D12,15と同時トランスフェクトされています。pANAPは、ANAP特異的tRNA/tRNAシンテターゼペアのいくつかのコピーをコードする。ANAPの存在下で、このプラスミドのトランスフェクションは、アンバー終止コドンを認識するANAPで荷電したtRNAを生成します。peRF1-E55Dは、完全長のANAPタグ付きタンパク質の収量を増加させるドミナントネガティブリボソーム放出因子をコードしています。 ANAPによる標識を目的としたコンストラクト用に、10 μg pANAP、10 μg peRF1-E55D、およびDNAを含む1.5 mLチューブを準備します。未添加のDMEMで最終容量を500 μLにします。 別のチューブで、DNA 1 μg ごとに脂質ベースのトランスフェクション試薬 ( 材料表参照) を 3 μL 調製し、未添加の DMEM で最終容量を 500 μL にします。 DNA とトランスフェクション試薬の混合物を 1 本のチューブにまとめ、室温で 20 分間インキュベートします。 400 μLの1 mM ANAPストック(30 mM NaOH中のトリフルオロ酢酸塩)を20 mLの添加DMEMに加えて、最終濃度20 μM ANAPにします。プレーティングした細胞の古い培地を、ディッシュあたり2 mLのANAP含有培地と交換します。 DNAトランスフェクションミックスの10%を各ディッシュにピペットで移します。実験前に33°Cで2〜4日間インキュベートします。33°Cでインキュベーションすると、細胞分裂が遅くなり、細胞あたりのタンパク質収量が増加します16。 4. 屋根なし膜実験 一対の鉗子を使用して、トランスフェクトされた細胞を含むカバースリップをより小さな断片に分割します。 以下のいずれかの手順に従って、セルの屋根を外します。プレコートされたカバースリップを使用する場合は、フラグメントをPBSですすぎ、2 mLのPBSを含む35 mmディッシュの底に置きます。サンプルの3〜5 mm上に配置されたプローブ超音波処理器(50 W、20%-40%振幅、3 mmプローブ)を使用して簡単に超音波処理し、細胞の屋根を外し、付着した原形質膜断片を残します(図2A、C)。注:ソニケーターのパワー、持続時間、およびサンプル上のプローブの高さはすべて、カバースリップを完全に露出させることなく、屋根のない膜の高収率を得るために変化させることができます。 プレコートされたカバースリップを使用しない場合は、カバースリップフラグメントをPBSですすぎ、0.1%w / vポリ-L-リジンを含むチューブに~30秒間浸してから、簡単に超音波処理します(ステップ4.2.1のように)屋根を外し、屋根のない/部分的に屋根のない原形質膜断片を残します(図2A、C、D)。ポリ-L-リジンへの短時間の曝露は、カバーガラス13への付着を改善することが実証されている。 超音波処理された断片を2mLの浴溶液を含むカバーガラス底35mm皿に入れ、高NA、60倍水浸対物レンズを備えた倒立顕微鏡にマウントする。顕微鏡のカメラポートは、高感度CCDカメラと直列に分光器に接続されています。蠕動ポンプを使用して、バスチャンバー(0.5 – 1 mL / min)をバッファーで灌流します。緩衝液の組成は、研究中のタンパク質によって異なります。注意: ユーザーが作動距離の長い対物レンズにアクセスできない場合、カバースリップの高さが余分なため、屋根のない膜の破片に焦点を合わせることができない場合があります。別の方法は、ポリ-L-リジンガラス底を有する皿に直接細胞を播種することである(例については 材料表 を参照)。これにより、2枚のガラスを通して焦点を合わせることに関連する画像の潜在的な収差も減少します。これらの収差は、取得されたスペクトルの形状に影響を与えません。 チャネル蛍光を探すことにより、ANAP標識チャネルを発現する屋根のない膜断片を同定します(図2C、D)。注:目的のタンパク質を含む屋根のない膜を識別するために、追加の蛍光標識(発光スペクトルがANAP発光スペクトルと区別できる場合)を使用することをお勧めします。図2のC、Dの実験は、C末端蛍光タンパク質タグを有するANAP標識チャネルで実施した。 分光器マスクを顕微鏡のカメラポートと分光器の間に部分的にかみ合わせます(~10%上げます)。マスクの影がカメラ画像に表示されます。顕微鏡ステージを調整して、屋根のないメンブレンを分光器マスクに合わせます。屋根のない膜の明視野と蛍光画像を取得します。これらは、分析する対象領域を選択するために使用されます。 マイクロボリューム灌流システムの先端を屋根のない膜に近づけます。注:バックグラウンド蛍光を低減するために、灌流システムの流出はホウケイ酸ガラス製のカスタムチップに置き換えられました。 蛍光スペクトルを画像化するには、390/18 nmバンドパス励起フィルターと416 nmエッジダイクロイックを介して385 nmのLEDでメンブレンを励起します。放射された光を400nmのロングパス発光フィルターに通します(図2B)。 分光器のマスクをかみ合わせ、放出された光が通過することを確認します。分光器のグレーティング(300溝/ mm)をかみ合わせます。格子を配置すると、分光器によって回折された光がCCDカメラのチップに投影され、スペクトル画像が生成されます(図3A)。これらの画像は、 y 次元の空間情報を保持します。 x 次元は波長に置き換えられます。 任意選択で、目的のタンパク質が蛍光タンパク質でタグ付けされている場合、適切なフィルターセットを使用して蛍光タンパク質のスペクトル画像を取得する。 実験の開始時に、ヌクレオチドを含まない緩衝液を灌流しながら、0.1〜10秒以上の曝露を1回以上行います。これらは、実験の残りの部分でデータを修正および正規化するために使用されます (以下のセクション 5 を参照)。注:露光時間の選択は、達成される発現レベル、蛍光色素の輝度、および光学系によって異なります。露光時間は、信号を最大化し、観察された漂白速度を最小限に抑えるように選択する必要があります。4.10で与えられた暴露時間範囲は、平衡結合測定に適しているが、より遅い速度変化を測定するために有用であり得る10。短い露光時間を使用してより速い動態を追跡する能力は、ハードウェアではなく、タンパク質発現レベルと光退色によって制限されます。 TNP-ATP(通常は浴溶液中で調製)の濃度の範囲を適用して、濃度-反応曲線を確立します。各溶液を少なくとも1分間灌流して定常状態に達することを確認し、各濃度を少なくとも1分間浴液で洗い流します。注:灌流システムが急速に平衡に達し(図2E)、TNP-ATPの正しい局所濃度を達成できることを確認することが重要です(図2F)。 各濃度と各ウォッシュアウトの最後に(ステップ4.10で使用したのと同じ期間で)曝露します。 5. スペクトル解析 注: これらの手順は、GitHub にある分析コード “pcf.m” で使用するために記述されています。https://github.com/mpuljung/spectra-analysis10。追加のコードと代替コードは、https://github.com/smusher/KATP_paper_201911にあります。ここでは、ユーザーが独自のコードを作成したり、データを手動で分析したりできるように、ソフトウェアによって実行される操作について説明しました。 コマンド ラインにプログラム名 (“pcf”) を入力して、解析プログラムを起動します。 ファイル/フォルダを開くダイアログボックスが開き、「ROI用のファイルを選択」というプロンプトが表示されたら、屋根のないメンブレンの明視野画像と蛍光画像に関連付けられたファイル名を選択します。出力ファイルの名前を入力するためのプロンプトがコマンドラインに表示されます。 ファイル名を入力してEnterキーを押します。 ソフトウェアが明視野画像と蛍光画像を表示したら、ソフトウェアプロンプトに従って、屋根のない膜片または切除されたパッチ(セクション6を参照)の位置に対応するスペクトル画像内の関心領域(ROI)を選択します。膜が取り付けられていないカバースリップまたはディッシュのセクションに対応する同じスペクトル画像(ROIと同じ波長範囲を表す)の背景領域を選択します(図3A)。ROIの上部をクリックしてEnterキーを押すように求められ、ROIの下部をクリックしてEnterキーを押してから、バックグラウンド領域に対してこのプロセスを繰り返します。 ファイル/フォルダを開くダイアログボックスが開き、「FPスペクトルのファイルを選択」というプロンプトが表示されたら、蛍光タンパク質(FP)スペクトルに関連付けられたファイル名を選択します(オプションのステップ4.9)。FPスペクトラムが集録されていない場合は、別のスペクトラムファイルを選択してください。FPスペクトルは、タグ付きタンパク質とバックグラウンド蛍光を区別するための品質管理として機能します。 「解析用のファイルを選択」というプロンプトでファイル/フォルダを開くダイアログボックスが開いたら、漂白補正に必要なファイルを含め、ANAPスペクトルに対応するすべてのファイル(ステップ4.10から4.12まで)を選択します。 「漂白収集用のファイルを選択」というプロンプトでファイル/フォルダを開くダイアログボックスが開いたら、実験開始時にヌクレオチドフリー溶液で取得した初期スペクトル、または補正に使用するヌクレオチドフリー溶液で洗浄中に取得したスペクトルに対応するステップ5.6のファイルのサブセットを選択します(ステップ4.10から4.12まで)。 スペクトルを生成するために各画像を線平均化する、すなわち、各波長におけるROIまたはバックグラウンド領域の y 次元内のすべてのピクセルの強度を平均化する。(図3B)。ROIから取得した平均スペクトルから得られた平均バックグラウンドスペクトルを差し引いて、非結合TNP-ATPからバックグラウンド蛍光および蛍光を除去します(図3C)。これらの手順は、ソフトウェアによって自動的に実行されます。 差し引かれたスペクトルのANAPピークを中心とした5 nmウィンドウの強度を平均することにより、各曝露のANAP強度を決定します(通常~470 nmですが、ANAP残基の局所微小環境に応じて異なる場合があります)。注: 図3D は、ANAPタグ付きチャネルを発現する屋根のない膜断片の連続した10秒間の曝露から得られた6つのスペクトルを示しています。挿入図は、各スペクトルのピークの平均強度を示す。ソフトウェアは、取得した最初のスペクトルのピーク波長を自動的に検出し、この値を全体を通して使用します。強度はソフトウェアによって自動的に計算されます。 特定のばく露のANAP強度(F)を、ステップ4.10で取得した時系列の最初のばく露のANAP強度(Fmax)で割ることにより、各実験のANAP強度を正規化します。この場合も、ソフトウェアはこれらの計算を自動的に実行します。 データを取得するには、以下の手順を実行してください。ANAP光退色を補正するには、まず、単一の指数関数的減衰(F / Fmax)= A*exp(-t / τ)+(1-A)、ここでtは累積露光時間、τは時定数、Aは振幅)を、TNP-ATPアプリケーション間の中間洗浄ステップまたはTNP-ATPでの洗浄前に行われた複数の初期露光のいずれかに適合させます(図3D、 挿入図)。注意: ソフトウェアはこのフィットを表示し、それを受け入れるか拒否するかを確認するプロンプトを表示します。フィットが拒否された場合、漂白補正用のファイルを選択する別の機会が提供されます。 正規化された(ステップ5.10の)ANAPスペクトルを、各時点でのステップ5.11.1からの指数適合の予測値で割ります(図3E)。注: 示されている例では、50 秒で観測された正規化されたピーク蛍光は 0.65 で、指数適合からの予測蛍光は 0.64 です。漂白を補正するには、観測値(0.65、図3E挿入図、空の円)を予測値(0.64、図3E挿入図、破線)で割って、補正値(~1、図3E挿入図、色付きの円)を生成します。漂白補正が適切であれば、ヌクレオチドの非存在下で得られたすべての曝露からのANAPの強度はほぼ等しくなければならない(図3E)。これらの計算は、ソフトウェアによって自動的に実行されます。 出力を、データをプロットした画像と、生のスペクトル、減算されたスペクトル、光退色のために補正されたスペクトル、および各ファイルのピークデータを含むタブ付きスプレッドシートとして取得して、さらに分析を行うことができます。 6. パッチクランプ蛍光測定実験 ピペット溶液で満たされたときに、厚肉のホウケイ酸ガラスキャピラリーからパッチピペットを1.5MΩから2.5MΩの抵抗まで引き出します。ピペット溶液の組成は、研究中のタンパク質によって異なります。 トランスフェクトした細胞を含むカバースリップを、2 mLの浴液を含むカバーガラス底35 mmディッシュに移し、高NA、60倍水浸対物レンズを備えた倒立顕微鏡にマウントします。蠕動ポンプを使用して、浴室(0.5 – 1 mL / min)をバス溶液で灌流します。ピペット溶液に関しては、浴溶液は研究中のタンパク質によって異なります。 細胞膜での蛍光を探すことにより、ANAP標識チャネルを発現する細胞を同定します。 パッチピペットにピペット溶液を入れます。ピペットに穏やかな陽圧を加え、バスチャンバーに入れます。ピペットを細胞の膜に押し付け、穏やかな吸引を加えてGΩシールを実現します(図4A)。 ピペットホルダーを細胞から素早く離してパッチを切除します(図4A)。注:この方法でパッチを切除すると、タンパク質の細胞質ドメインが灌流系にさらされた裏返しのパッチが形成されます。研究中のヌクレオチド結合部位の位置が細胞質でない場合は、PCF実験を行うためにアウトサイドアウトパッチまたは全細胞記録を使用する必要があります。 パッチピペットの先端を灌流システムの先端に近づけ、パッチが分光器マスクのスリット内にあることを確認します(図4A)。 ステップ4.10-4.12のようにTNP-ATPと画像スペクトルを適用し、同時にヌクレオチド適用に対するイオン電流応答を記録します。注意: ピペットガラスは、取得した画像に空間収差や反射をもたらす可能性があります。ただし、これらの収差は取得したスペクトルの形状に影響を与えず、反射励起光は分光器またはロングパス発光フィルターのいずれかを使用して蛍光から簡単に分離できます。 スペクトルを分析します。切り出したパッチから画像化されたスペクトルは、パッチピペットのガラスからTNP-ATPが排除されるため、未結合のTNP-ATP蛍光の過剰減算を示す可能性があります(図4C-E)。この過減算はANAP発光スペクトルに影響しないため、無視してかまいません。注:切除パッチの蛍光シグナルは屋根のないメンブレンよりも低くなるため、ANAPを急速に漂白することなく十分に高い信号対雑音比が得られる露光時間を使用することが重要です。