Yüksek Titer Hepatit E Virüs Stokları Üretmek için Bir Hücre Kültürü Modeli

Hepatit E, dünya çapında yaygınlığı artan oldukça hafife alınmış bir hastalıktır. Yaklaşık 20 milyon enfeksiyon yılda 70.000’den fazla ölümle sonuçlanır^1. Altta yatan ajan, Hepatit E virüsü (HEV), yakın zamanda yeniden atandı ve şimdi cins Orthohepevirus ve Piscihepevirus dahil olmak üzere aile Hepeviridae içinde sınıflandırılır. Çeşitli kökenlerden HEV insanlar, domuz, tavşan, sıçan, kuş ve diğer memeliler 2 izole de dahil olmak üzere orthohepevirus A-D türleri içinde^{sınıflanır.} Şu anda, sekiz farklı genotip (GT) pozitif odaklı, tek iplikçikli RNA virüsü tespit edilmiştir². Dizikimlikleri, iletim yolları ve coğrafi dağılımları farklılık belirtse ler de genomik yapıları son derece korunmuştur. Daha spesifik olan 7.2 kbp HEV genomu 3 ana açık okuma çerçevesine (ORF1-3) ayrılmıştır. ORF1 konak hücre içinde başarılı bir çoğaltma için gerekli tüm enzimleri kodlarken, ORF2 capsid proteinini kodlar ve ORF3 proteini enfeksiyöz partiküllerin toplanması ve serbest bırakılması için gerekli olan işlevsel bir iyon kanalı olarak çalışır³. Bir kez bazal veya apikal lümen HEV içine yayımlanan her iki, yarı ve zarflı olmayan / çıplak türler virüs kan veya dışkı, sırasıyla^4,5kaynaklı olup olmadığına bağlı olarak var .

GT1 ve GT2 daha çok gelişmekte olan ülkelerde bulunurken, sadece dışkı-oral yol ile^{insanlara 6} bulaştıran, GT3, GT4 ve GT7 ağırlıklı olarak gelişmiş ülkelerde meydana¹,⁷ rezervuarlar olarak hizmet veren türlerin çeşitli^ile,örneğin, domuz⁸, sıçan⁹, tavuk^10,11, geyik¹², firavun faresi¹³, yarasa¹⁴, tavşan^15,16, yaban domuzu¹⁷ ve daha birçok^7,18,19, zoonoz kanıt sağlayan^7,20,21,22. Yetersiz sıhhi koşullara ek olarak²³ ve kontamine gıda ürünleri^12,24,25,26, kan transfüzyonu ve organ nakli ile iletim de^{mümkündür 27,28}. HEV karaciğer sirozu ve karaciğer yetmezliği nin sık görülen bir nedenidir²⁹ özellikle önceden var olan karaciğer hastalığı olan hastalarda, bağışıklık sistemi zayıf bireylerde (genotip 3, 4 ve 7) ve gebe kadınlarda (genotip 1). Not, hematopoetik hastalık³⁰gibi ekstrahepatik belirtileri de vardır^{30 ,31,32}, nörolojik bozukluklar³³ ve böbrek hasarı³⁴.

Bugüne kadar, off-label ilaç ribavirin (RBV) birçok enfekte hastalar için tercih edilen tedavi^35,36. Ancak, tedavi başarısızlığı ve kötü klinik uzun vadeli sonuçlar vakaları bildirilmiştir. Tedavi yetmezliği viral mutagenez ve kronik enfekte hastalarda artmış viral heterojenite ile bağlantılı olmuştur^37,38,39. Aksine, yakın zamanda yapılan bir Avrupa retrospektif çok merkezli çalışma da polimeraz mutasyonlarını RBV tedavi yetmezliği⁴⁰ile ilişkilendiremedi. Klinik gözlemler ve in vitro deneylerde, interferon^41,42,43, sofosbuvir^44,45, çinko tuzları 46 ve silvestrol^{47 47,48} de antiviral etkileri göstermiştir. Bununla birlikte, hev yaşam döngüsü ve patogenezi hakkında bilgi eksikliği engel, belirli bir HEV tedavisi bulunabilir kalır. Bu nedenle, virolojik çalışmalar ve yeni antiviral ilaçların geliştirilmesi için sağlam bir hücre kültür sistemi acilen ihtiyaç vardır⁴⁹.

Ne yazık ki, diğer hepatit virüsleri gibi, HEV konvansiyonel hücre hatlarında yaymak zordur ve genellikle çok yavaş düşük viral yüklere yol ileir. Yine de, bazı gruplar hücre hattı subklonlar üretimi tarafından viral yükleri artırmak başardık⁵⁰ veya medya takviyeleri ayarı⁵¹. Son zamanlarda cDNA klonlar üretimi⁵² ve primer hastanın adaptasyon geçerek izole^53,54 hücre kültüründe daha iyi HEV yayılımı⁵⁵. Bu protokolde, kernow-C1 suş adapte bir hücre kültürünün genomu kullanılan (p6_WT olarak anılacaktır)⁵⁴ ve bir mutant suş bir çoğaltma arttırıcı mutasyon barındıran (p6_G1634R olarak anılacaktır)^37. Kernow-C1 HEV hücre kültüründe en sık kullanılan suşudur ve yüksek viral yükler üretebilme yeteneğine sahiptir. Viral RNA kopya sayıları değerlendirilerek, HEV replikasyonu in vitro olarak izlenebilir. Bununla birlikte, bu teknikler üretilen enfeksiyöz partikül sayısının değerlendirilmesini izin vermez. Bu nedenle Odak Şekillendirme Birimlerini (FFU/mL) belirlemek için immünoresans boyama sistemi kurduk.

Burada açıklanan yöntem⁵⁶ birincil hücreler ve memeli hücre hatları da dahil olmak üzere çeşitli kökenlerden hücre türleri çeşitli enfekte yeteneğine sahip tam uzunlukta bulaşıcı viral parçacıklar üretmek için kullanılabilir. Bu HEV enfeksiyonu ve tropizm önemli yönlerini deşifre etmek için temel bir ön koşuldur. Genellikle sınırlı hasta izole ile aşılama için gerek yoktur. Plazmidlerden enfeksiyöz HEV partiküllerinin üretimi sonsuz bir kaynak oluşturur ve bu da protokolü nispeten verimli kılar. Buna ek olarak, bu sistem in vivo tanımlanan genom değişimi ve HEV replikasyon ve fitness üzerindeki etkileri çalışma sağlayan ters genetik için kullanılabilir. Bu teknik birçok sınırlamanın üstesinden gelmekte ve ilaç gelişimi, mutagenez çalışmaları ve kısıtlama veya giriş faktörleri gibi virüs-konak etkileşimlerinin değerlendirilmesi için yol olabilir.