Un modelo de cultivo celular para producir acciones de virus de la hepatitis E de alto título

La hepatitis E es una enfermedad bastante subestimada con una prevalencia cada vez mayor en todo el mundo. Alrededor de 20 millones de infecciones provocan más de 70.000 muertes al año¹. El agente subyacente, el virus de la hepatitis E (HEV), fue reasignado recientemente y ahora se clasifica dentro de la familia Hepeviridae incluyendo los géneros Orthohepevirus y Piscihepevirus. HEV de diversos orígenes se clasifican dentro de la especie Orthohepevirus A-D incluyendo aislados de humanos, cerdos, conejos, ratas, aves y otros mamíferos². En la actualidad, se han identificado ocho genotipos diferentes (GT) del virus de ARN de una sola cadena de orientación positiva². Aunque difieren en su identidad de secuencia, rutas de transmisión y distribución geográfica, su estructura genómica es altamente conservada. Más específico, el genoma HEV de 7,2 kbp se divide en 3 marcos de lectura abiertos principales (ORF1-3). Mientras ORF1 codifica todas las enzimas necesarias para una replicación exitosa dentro de la célula huésped, ORF2 codifica la proteína capsid, y la proteína ORF3 funciona como un canal iónico funcional necesario para el montaje y liberación de partículas infecciosas^3. Una vez liberado en el lumen basal o apical HEV existe en ambas especies, casi biseladas y no envueltas/desnudas dependiendo de si el virus se origina en sangre o heces, respectivamente^4,5.

Mientras que GT1 y GT2 se encuentran principalmente en los países en desarrollo que infectan únicamente a los seres humanos⁶ a través de la vía fecal-oral, GT3, GT4 y GT7 se producen predominantemente en los países desarrollados^1,,7 con una variedad de especies que sirven como reservorios, por ejemplo, cerdo⁸, rata⁹, pollo^10,11, ciervo¹², mangosta¹³, murciélago¹⁴, conejo^15,16, jabalí¹⁷ y muchos más^7,18,19, proporcionando evidencia de zoonosis^7,20,21,22. Además de las condiciones sanitarias inadecuadas²³ y los productos alimenticios contaminados^12,24,25,26, la transmisión a través de transfusión de sangre y trasplantes de órganos también es posible^27,28. El HEV es una causa frecuente de cirrosis hepática e insuficiencia hepática^29, especialmente en pacientes con enfermedad hepática preexistente, individuos inmunocomprometidos (genotipo 3, 4 y 7) y mujeres embarazadas (genotipo 1). Cabe destacar que también hay manifestaciones extrahepáticas como la enfermedad hematopoyética^30,31,32, trastornos neurológicos³³ y lesión renal³⁴.

Hasta la fecha, el medicamento fuera de etiqueta ribavirina (RBV) es el tratamiento de elección para muchos pacientes infectados^35,36. Sin embargo, se han notificado casos de insuficiencia del tratamiento y malos resultados clínicos a largo plazo. La insuficiencia del tratamiento se ha relacionado con la mutagénesis viral y el aumento de la heterogeneidad viral en pacientes infectados crónicamente^37,38,39. Por el contrario, un reciente estudio multicéntrico retrospectivo europeo no fue capaz de correlacionar las mutaciones de la polimerasa con la falla del tratamiento con RBV⁴⁰. En observaciones clínicas y experimentos in vitro, el interferón^41,42,43, sofosbuvir^44,45, sales de zinc⁴⁶ y silvestrol^47,48 también han mostrado efectos antivirales. No obstante, queda por encontrar un tratamiento específico para el HEV, obstaculizado por la falta de conocimiento sobre el ciclo de vida del HEV y su patogénesis. Por lo tanto, se necesita urgentemente un sistema de cultivo celular robusto para estudios virológicos y el desarrollo de nuevos medicamentos antivirales⁴⁹.

Desafortunadamente, al igual que otros virus de la hepatitis, el HEV es difícil de propagar en las líneas celulares convencionales y por lo general progresa muy lentamente, lo que conduce a bajas cargas virales. Sin embargo, algunos grupos fueron capaces de aumentar las cargas virales mediante la generación de subclones de línea celular⁵⁰ o el ajuste de los suplementos de medios⁵¹. Recientemente la generación de clones de ADNc⁵² y la adaptación de aislados primarios de pacientes mediante la transmisión^{de 53,,54} mejoraron aún más la propagación del HEV en el cultivo celular⁵⁵. En este protocolo, utilizamos el genoma de un cultivo celular adaptado a la cepa Kernow-C1 (denominada p6_WT)⁵⁴ y una cepa mutante que alberga una mutación que mejora la replicación (denominada p6_G1634R)³⁷. Kernow-C1 es la cepa más utilizada en el cultivo celular HEV y es capaz de producir altas cargas virales. Mediante la evaluación de los números de copia de ARN viral, la replicación de HEV se puede monitorear in vitro. Sin embargo, estas técnicas no permiten evaluar el número de partículas infecciosas que se producen. Por lo tanto, hemos establecido una tinción de inmunofluorescencia para determinar las unidades formadoras de enfoque (FFU/ml).

El método⁵⁶ descrito aquí se puede utilizar para producir partículas virales infecciosas de longitud completa que son capaces de infectar una variedad de tipos de células de diversos orígenes, incluyendo células primarias y líneas celulares de mamíferos. Este es un requisito previo fundamental para descifrar aspectos importantes de la infección por HEV y el tropismo. No hay necesidad de inoculación con aislados de pacientes generalmente limitados. La producción de partículas HEV infecciosas a partir de plásmidos plantea una fuente infinita, lo que hace que este protocolo sea comparativamente eficiente. Además, este sistema se puede utilizar para la genética inversa que permite el estudio de la alteración del genoma identificado in vivo y su impacto en la replicación y la aptitud del HEV. Esta técnica supera muchas limitaciones y, puede buscar el camino para el desarrollo de fármacos, estudios de mutagénesis y la evaluación de interacciones virus-huésped como restricciones o factores de entrada.