Um modelo de cultura celular para produzir estoques de vírus de hepatite E de alta titer

A hepatite E é uma doença bastante subestimada com aumento da prevalência em todo o mundo. Cerca de 20 milhões de infecções resultam em mais de 70.000 mortes por ano¹. O agente subjacente, o vírus da Hepatite E (HEV), foi transferido recentemente e agora é classificado dentro da família Hepeviridae, incluindo os gêneros Ortohepevirus e Piscihepevirus. HEV de várias origens são classificados dentro da espécie Orthohepevirus A-D, incluindo isolados de humanos, suínos, coelhos, ratos, aves e outros mamíferos². Atualmente, foram identificados oito genótipos diferentes (GT) do vírus RNA de rna de apenas encalhe positivamente². Embora diferam em sua identidade sequencial, rotas de transmissão e distribuição geográfica, sua estrutura genômica é altamente conservada. Mais específico, o genoma HEV de 7,2 kbp é dividido em 3 principais quadros de leitura aberta (ORF1-3). Enquanto o ORF1 codifica todas as enzimas necessárias para uma replicação bem sucedida dentro da célula hospedeira, o ORF2 codifica a proteína capsid, e a proteína ORF3 opera como um canal de íon funcional necessário para montagem e liberação de partículas infecciosas³. Uma vez liberado no lúmen basal ou apical HEV existe em ambas as espécies quasienveloped e não-envolto/nu, dependendo se o vírus se origina de sangue ou fezes,^{respectivamente 4,5}.

Enquanto GT1 e GT2 são encontrados principalmente em países em desenvolvimento infectando^apenas humanos 6 através da rota fecal-oral, GT3, GT4 e GT7 ocorrem predominantemente nos países desenvolvidos^1,7 com uma variedade de espécies servindo como reservatórios, por exemplo, suíno⁸, rato⁹, frango^10,11, veado¹², mangusto¹³, morcego¹⁴, coelho^15,16, javali selvagem¹⁷ e muito mais^7,18,19, fornecendo evidências de zoonose^7,20,21,22. Além das condições sanitárias inadequadas²³ e dos produtos alimentícios contaminados^{12,24,,25,,26}, a transmissão via transfusão de sangue e transplantes de órgãos também é possível^27,28. O HEV é uma causa comum de cirrose hepática e insuficiência hepática^{29 especialmente} em pacientes com doença hepática pré-existente, indivíduos imunocomprometidos (genótipo 3, 4 e 7) e gestantes (genótipo 1). Note-se que há também manifestações extrahápticas como a doença hematopoiética^30,31,,32, distúrbios neurológicos³³ e lesão renal³⁴.

Até o momento, o medicamento off-label ribavirin (RBV) é o tratamento de escolha para muitos pacientes infectados^35,36. No entanto, casos de falha no tratamento e desfechos clínicos ruins a longo prazo foram relatados. A falha no tratamento tem sido associada à mutagênese viral e ao aumento da heterogeneidade viral em pacientes cronicamente infectados^37,38,39. Pelo contrário, um estudo multicêntrico retrospectivo europeu recente não foi capaz de correlacionar mutações de polimerase à falha do tratamento RBV⁴⁰. Em observações clínicas e experimentos in vitro, interferon^41,42,43, sofosbuvir^44,45, sais de zinco⁴⁶ e silvestrol^47,48 também mostraram efeitos antivirais. No entanto, ainda há um tratamento específico de HEV, dificultado pela falta de conhecimento sobre o ciclo de vida hev e sua patogênese. Portanto, é^urgenteum sistema de cultura celular robusto para estudos virológicos e o desenvolvimento de novas drogas antivirais.

Infelizmente, como outros vírus da hepatite, o HEV é difícil de propagar em linhas celulares convencionais e geralmente progride muito lentamente levando a baixas cargas virais. No entanto, alguns grupos foram capazes de aumentar as cargas virais pela geração de subclones de linha^{celular 50} ou pelo ajuste dos suplementos de mídia⁵¹. Recentemente, a geração de clones cDNA⁵² e a adaptação dos isolados do paciente primário pela passagem^53,54 melhorou ainda mais a propagação de HEV na cultura celular⁵⁵. Neste protocolo, usamos o genoma de uma cultura celular adaptada linhame a cepa Kernow-C1 (chamada de p6_WT)⁵⁴ e uma cepa mutante que abriga uma mutação que aumenta a replicação (chamada de p6_G1634R)³⁷. Kernow-C1 é a cepa mais usada na cultura celular HEV e é capaz de produzir altas cargas virais. Ao avaliar os números de cópias do RNA viral, a replicação hev pode ser monitorada in vitro. No entanto, essas técnicas não permitem avaliar o número de partículas infecciosas que estão sendo produzidas. Por isso, estabelecemos uma coloração de imunofluorescência para determinar unidades de formação de foco (FFU/mL).

O método⁵⁶ aqui descrito pode ser usado para produzir partículas virais infecciosas de comprimento total que são capazes de infectar uma variedade de tipos celulares de diversas origens, incluindo células primárias e linhas celulares de mamíferos. Este é um pré-requisito fundamental para decifrar aspectos importantes da infecção por HEV e do tropismo. Não há necessidade de inoculação com isolados geralmente limitados de pacientes. A produção de partículas infecciosas de HEV a partir de plasmídeos representa uma fonte infinita, o que torna este protocolo comparativamente eficiente. Além disso, esse sistema pode ser usado para genética reversa, permitindo o estudo da alteração do genoma identificada in vivo e seu impacto na replicação e aptidão do HEV. Essa técnica supera muitas limitações e pode trilhar o caminho para o desenvolvimento de medicamentos, estudos de mutagênese e a avaliação de interações vírus-hospedeiros, como fatores de restrição ou entrada.