高力子型E型肝炎ウイルス株を生産するための細胞培養モデル

E型肝炎は、世界的に有病率が高まっている、かなり過小評価されている病気です。約2,000万人の感染により、年間70,000人以上の死者^{が出ます。}基礎となるE型肝炎ウイルス(HEV)は最近再割り当てされ、現在はゲネラオルソヘペウイルスおよびピシヘペウイルスを含むヘペビリダ科内に分類されている。様々な起源のHEVは、ヒト、豚、ウサギ、ラット、鳥類および他の哺乳動物からの分離物を含む種オルソヘペウイルスA-D内で分類される^2。現在、陽性指向の一本鎖RNAウイルスの8種類の遺伝子型(GT)が^{同定されている2.}彼らは彼らの順序の同一性、伝達および地理的分布の経路で異なるが、彼らのゲノム構造は非常に保存されている。より具体的には、7.2 kbp HEVゲノムは、3つの主要なオープンリーディングフレーム(ORF1-3)に分けられる。ORF1は、宿主細胞内での複製を成功させるために必要なすべての酵素をコードするが、ORF2はキャプシドタンパク質をコードし、ORF3タンパク質は感染性粒子の組み立ておよび放出に必要な機能的イオンチャネルとして動作^する3。一旦基礎または座端腔HEVに放出されると、両方に存在し、ウイルスがそれぞれ^,4、5に由来するかどうかに応じて、準エンベロープおよび非エンベロープ/裸の種である。⁴

GT1とGT2は主に発展途上国で見られるが、便経口経路を介して人間⁶に感染しているだけで、 GT3、GT4、GT7は主に先進国^{7,18,19,11、7}は、例えば、豚^8、ラット^9、鶏^10、11、鹿^12、マングース13、コウモリ14、ウサギ15、マングース^13、コウモリ^14、ウサギ^{715、16、,16}イノ¹¹シシ^17、動物園^17,7、20、212の証拠を提供する様々な種で発生^{20,21します22}。不十分な衛生状態²³および汚染された食品^{12、24、25、2624,25,26}に加えて、輸血および臓器移植による伝染も可能¹²である^{27、28。27,}HEVは、肝硬変および肝不全²⁹の一般的な原因であり、特に既存の肝疾患を有する患者、免疫不全個体(遺伝子型3、4および7)および妊婦(遺伝子型1)においてである。注意すべきは、造血^,性疾患^{30、31、32、神経障害33,31}および腎障害³²³⁴のような肝外症状もある。³⁴

現在までに、オフラベル薬リバビリン(RBV)は、多くの感染患者^35、36,36のための選択の治療です。しかし、治療不全および臨床長期的な結果の悪い症例が報告されている。治療の失敗は、ウイルス性突然変異誘発に関連しており、慢性感染患者^{37、38、3938,39}におけるウイルス不均一性の増加。³⁷それどころか、最近のヨーロッパの回顧的な多施設研究では、ポリメラーゼ突然変異をRBV治療失敗⁴⁰に関連付けることができなかった。臨床観察およびインビトロ実験において、インターフェロン41、42、43、ソフォスブビル^{41,42,434444、45、45}亜鉛塩⁴⁶およびシルヴェストロール^47、48,48も抗ウイルス効果を示している。それにもかかわらず、HEVのライフサイクルとその病因に関する知識の欠如によって妨げられ、特定のHEV治療が見つかっていない。したがって、ウイルス学的研究と新しい抗ウイルス薬の開発のための堅牢な細胞培養システムが緊急に必要とされる^49.

残念ながら、他の肝炎ウイルスと同様に、HEVは従来の細胞株で伝播することは困難であり、通常は非常にゆっくりと進行し、低いウイルス負荷につながる。それにもかかわらず、いくつかのグループは、細胞株サブクローン⁵⁰の生成またはメディアサプリメント⁵¹の調整によってウイルス負荷を高めることができた。最近cDNAクローン⁵²の生成と一次患者の適応は、細胞培養⁵⁵におけるHEV伝播をさらに改善^{し、53、5454}を通過させることによって分離する。⁵³このプロトコルでは、セル培養用のゲノムを用いて、Kernow−C1株^(p6_WT)54と、複製増強突然変異(p6_G1634Rと呼ばれる⁾³⁷を収容する変異株とを用いた。Kernow-C1はHEV細胞培養で最も頻繁に使用される株であり、高いウイルス負荷を産生することができる。ウイルスRNAコピー数を評価することにより、HEV複製をインビトロで監視することができる。それにもかかわらず、これらの技術は、産生される感染性粒子の数の評価を可能にしない。そこで、フォーカス形成ユニット(FFU/mL)を決定するための免疫蛍光染色を確立しました。

ここに記載した方法⁵⁶は、初等細胞および哺乳動物細胞株を含む多様な起源から様々な細胞型に感染することができる全長感染性ウイルス粒子を産生するために使用することができる。これはHEV感染とトロピズムの重要な側面を解読するための基本的な前提条件です。通常限られた患者の隔離で接種する必要はない。プラスミドからの感染性HEV粒子の生成は無限の源であり、このプロトコルは同等に効率的である。さらに、このシステムは、in vivo同定されたゲノム改変の研究とHEV複製および適合性への影響を可能にする逆遺伝学に使用することができる。この技術は多くの制限を克服し、薬物開発、突然変異誘発研究、および制限または侵入因子などのウイルス宿主相互作用の評価への道を歩むことができる。