نموذج ثقافة الخلية لإنتاج ارتفاع الأسهم فيروس التهاب الكبد Titer E

التهاب الكبد E هو مرض أقل من الواقع إلى حد ما مع تزايد انتشاره في جميع أنحاء العالم. حوالي 20 مليون إصابة تؤدي إلى أكثر من 70،000 حالة وفاة سنويا¹. تم إعادة تعيين العامل الكامن، فيروس التهاب الكبد E (HEV)، مؤخرًا، وهو الآن مصنف داخل Hepeviridae العائلية بما في ذلك فيروس جينيرا أورثوبي وفيروس بيستشيهيبي. يتم تصنيف HEV من أصول مختلفة ضمن الأنواع Orthohepevirus A-D بما في ذلك عزل عن البشر والخنازير والأرانب والجرذان والطيور والثدييات الأخرى². في الوقت الحاضر، تم تحديد ثمانية أنواع جينية مختلفة (GT) من فيروس الحمض النووي الريبي الإيجابي الموجه، الذي تقطعت به السبل واحد². وعلى الرغم من اختلافها في هوية تسلسلها وطرق نقلها وتوزيعها الجغرافي، إلا أن هيكلها الجيني يحافظ عليه بدرجة عالية. أكثر تحديدا، 7.2 كيلو بايت 10000 1000 1000 1000 1000 1000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 بينما ORF1 ترميز جميع الإنزيمات اللازمة للنسخ المتماثل الناجح داخل الخلية المضيفة، ORF2 ترميز البروتين capsid، والبروتين ORF3 تعمل كقناة أيون وظيفية مطلوبة للتجميع وإطلاق الجزيئات المعدية³. مرة واحدة أطلقت في التجويف القاعدية أو apical HEV موجود في كل من, شبه مظلومة والأنواع غير مغلفة / عارية اعتمادا على ما إذا كان الفيروس ينشأ من الدم أو البراز, على التوالي^4,5.

في حين أن GT1 و GT2 توجدان بشكل رئيسي في البلدان النامية تصيب البشر^{فقط 6} عبر الطريق الفموي البرازي ، فإن GT3 و GT4 و GT7 تحدث بشكل رئيسي في البلدان المتقدمة^1،7 مع مجموعة متنوعة من الأنواع التي تخدم كمكامن ، على سبيل المثال، الخنازير⁸، الجرذ⁹، الدجاج^10،11، الغزلان¹²، النمس 13 ، الخفافيش¹⁴، الأرانب^15،16، الخنزير البري¹⁷ والعديد من أكثر^7،18،19، تقديم أدلة على zoonosis^{7،1320،21،22}. بالإضافة إلى الظروف الصحية غير كافية²³ والمنتجات الغذائية الملوثة^12,24,25,26, انتقال عن طريق نقل الدم وزرع الأعضاء هو أيضا ممكن^27,28. HEV هو سبب شائع لتليف الكبد وفشل الكبد²⁹ خاصة في المرضى الذين يعانون من أمراض الكبد الموجودة من قبل ، والأفراد المناعيين (النمط الجيني 3 و 4 و 7) والنساء الحوامل (النمط الجيني 1). ملاحظة، وهناك أيضا مظاهر خارج الكبد مثل مرض الدم^30،31،32، الاضطرابات العصبية³³ والإصابات الكلوية³⁴.

حتى الآن, خارج التسمية المخدرات ريبافيرين (RBV) هو العلاج المفضل بالنسبة للعديد من المرضى المصابين^35,36. ومع ذلك، فقد تم الإبلاغ عن حالات فشل في العلاج وضعف النتائج السريرية على المدى الطويل. وقد تم ربط فشل العلاج إلى الطفرات الفيروسية وزيادة التجانس الفيروسي في المرضى المصابين بشكل مزمن^37,38,39. على العكس من ذلك، لم تكن دراسة متعددة المراكز الأوروبية بأثر رجعي الأخيرة قادرة على ربط طفرات البوليميراز بفشل العلاج RBV⁴⁰. في الملاحظات السريرية والتجارب في المختبر, إنترفيرون^41,,42,,43, sofosbuvir^44,45, أملاح الزنك⁴⁶ و silvestrol^47,,48 كما أظهرت آثار مضادة للفيروسات. ومع ذلك، لا يزال هناك علاج محدد لـ HEV لا يزال يتعين العثور عليه، ويعيقه نقص المعرفة حول دورة حياة HEV والعوامل المسببة للمرض. ولذلك، هناك حاجة ماسة إلى نظام قوي لثقافة الخلايا للدراسات الفيروسية وتطوير أدوية جديدة مضادة للفيروسات⁴⁹.

لسوء الحظ، مثل فيروسات التهاب الكبد الأخرى، من الصعب نشر HEV في خطوط الخلايا التقليدية وعادة ما يتقدم ببطء شديد مما يؤدي إلى انخفاض الأحمال الفيروسية. ومع ذلك، كانت بعض المجموعات قادرة على زيادة الأحمال الفيروسية من خلال توليد من خلية خط subclones⁵⁰ أو تعديل وسائل الاعلام ملاحق⁵¹. في الآونة الأخيرة جيل استنساخ cDNA⁵² والتكيف مع عزل المريض الابتدائي عن طريق passaging^53،54 مزيد من تحسين انتشار HEV في خلية ثقافة⁵⁵. في هذا البروتوكول، استخدمنا جينوم ثقافة الخلية تكييف Kernow-C1 سلالة (يشار إليها باسم p6_WT)⁵⁴ وسلالة متحولة إيواء طفرة تعزيز النسخ المتماثل (يشار إليها باسم p6_G1634R)³⁷. Kernow-C1 هو السلالة الأكثر استخداما في ثقافة الخلية HEV وقادرة على إنتاج الأحمال الفيروسية العالية. من خلال تقييم أعداد نسخ الحمض النووي الريبي الفيروسي ، يمكن رصد النسخ المتماثل HEV في المختبر. ومع ذلك، فإن هذه التقنيات لا تسمح بتقييم عدد الجسيمات المعدية التي يجري إنتاجها. لذلك، أنشأنا تلطيخ مناعيا لتحديد وحدات تشكيل التركيز (FFU / مل).

يمكن استخدام الطريقة⁵⁶ الموصوفة هنا لإنتاج جزيئات فيروسية معدية كاملة الطول قادرة على إصابة مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا من أصول متنوعة بما في ذلك الخلايا الأولية وخطوط خلايا الثدييات. هذا هو شرط أساسي لفك الجوانب الهامة من العدوى HEV وtropism. ليست هناك حاجة لللقح مع عزل المريض عادة محدودة. إنتاج الجسيمات HEV المعدية من البلازميدات يشكل مصدرا لا حصر له، مما يجعل هذا البروتوكول فعالة بالمقارنة. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام هذا النظام لعلم الوراثة العكسية تمكين دراسة في تحوي تغير الجينوم المحدد وتأثيرها على تكرار HEV واللياقة البدنية. هذه التقنية تتغلب على العديد من القيود ، ويمكن أن المسار الطريق لتطوير المخدرات ، والدراسات المطفرة وتقييم التفاعلات استقبال الفيروس مثل العوامل المقيدة أو الدخول.