Nörodejenerasyon ile Birlikte Erişkin Drosophila'da Sinaptik Dejenerasyonun Görselleştirilmesi

1. Transgenik sinek üretimi Bu deney için transgenik sinekler oluşturmak için, OK371-Gal425 bakire dişi sinekler ve UAS-TDP-43M337V 26 (Şekil 1A)erkek toplamak bir yastık üzerinde CO2 ile sinekler anestezi tarafından sıralamak için. Çapraz için standart Drosophila medya ile şişeler halinde anestezi sinekler sıralamak. Yeni neslin ortaya çıkması için etiketli şişeleri 25 °C’ye yerleştirin.NOT: Uygun genotipsağlamak için döl ortaya çıkmadan önce yetişkinleri şişelerden temizleyin. Bir kez döl ortaya, şişeler halinde transgenik sinekler toplamak ve deneysel koşullar için yaşlanmaya başlamak için cinsiyete göre sıralamak. Sinekler toplandıktan sonra sinekler 21 günlük olana kadar her 2 günde bir taze yiyeceklere aktarın. 2. Diseksiyon hazırlığı Diseksiyonlar için hazırlanmak için, oda sıcaklığında fosfat tamponlu salin (1x PBS), silikon elastomer ile kaplanmış 10 cm’lik bir diseksiyon kabı, düz kenar kesme makası, künt diseksiyon forsepsbir set, P200 pipet ve pipet uçları, 2.0 mL mikrosantrifüj tüpler, standart ofis makas, 70% etanol, 6 cm Petri çanak, ve 32% formaldehit 1x PBS ile% 4 seyreltilmiş. Her genotip veya durum için etiket tüpleri ve her tüpe 900 μL 1x PBS (oda sıcaklığı) ve 150 μL formaldehit ekleyin. %4 formaldehit fiksatifhazırlarken eldiven ve güvenlik gözlüğü takın. Anestezi 6\u201210 co2 ile şişe doğrudan grup başına uçar ve% 70 etanol ile 6 cm Petri çanak içine sular. Numunelerin tamamen batırılmış olduğundan emin olmak için bir boya fırçası kullanarak etanolün içine bastırın. Bu dış manikül üzerinde yağ tabakası kaldıracaktır. 3. Toraks izolasyonu ve fiksasyonu Her numuneyi incelemeden önce, silikon elastomerle kaplanmış diseksiyonu kabına yaklaşık 7\u201210 mL 1x PBS ekleyin. Bu hacim doku örneklerinin tamamen batırılmış olduğundan emin olmalıdır. Künt forceps kullanarak ve kanatveya bacaklar kavramak kullanarak% 70 etanol diseksiyon çanak bir sinek aktarın. Örneği bir diseksiyon mikroskobu altında diseksiyon kabına odaklayın. Sonraki 1x PBS örnek batırın ve dikkatle künt Dumont #5 ince forceps kullanarak kanatları çıkarın. Vannas düz kenar yay diseksiyonu makası kullanarak, mite ventral tarafında küçük bir kesi oluşturarak bacaklar çıkarın. Adım 3.8′ de, bu kesi formaldehitin dokuya nüfuz etmesini sağlayacak. Bir elinde makas alın ve sinek ventral tarafı konumlandırmak için diğer forseps tutun. Künt forceps ile yerde örnek tutarken, diseksiyon makas ile baş ve karın çıkarın. Modifiye pipet ucunu kullanarak izole toraksı 3.2 adımdan etiketlenmiş tüpe aktarın.NOT: Fiksatife ekstra 1x PBS eklememek için pipeti 40 μL’ye ayarlayın. Her numune için yukarıdaki 3.2\u20123.6 adımlarını tekrarlayın. Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca örnekleri düzeltin. Pasteur pipetini kullanarak düzeltmeyi çıkarın ve duman kaputunun altındaki uygun atık kabına atın. Pasteur pipeti kullanarak her biri 1,5 mL 1x PBS ile üç kez durulayın. Sadece 750 μL kullanarak dördüncü bir durulama tamamlayın ve 1x PBS dokuları bırakın.NOT: Bu noktada doku örnekleri sonraki adımlara geçmeden önce 3 gün ekadar 4 °C’de kalabilir. 4. Flaş donma ve toraks bisection Bisections başlamadan önce, uygun kriyo-koruyucu eldiven ve güvenlik gözlükleri giyen sıvı nitrojen ile bir Dewar şişesi doldurun. Bir bıçak kırıcı, tüy bıçaklar, bir çift ince çöke, buz, buz gibi 1x PBS ve kriyojenik cımbız elde edin. 1x PBS buz gibi tutmak için bir buz kovası hazırlayın. Bir açıda tüy bıçak kapmak için bıçak kırıcı kullanın ve küçük bir parça kırmak için bıçak viraj. Bıçak kırıcı daha sonra küçük bir neşter olarak kullanılmak üzere pozisyonda bıçak kilitleyebilirsiniz.NOT: Bir bıçak tüm gruplar için sürmelidir. Bıçak kırılırsa veya donuklaşırsa değiştirin. P200’e temiz bir pipet ucu ekleyin ve numuneleri taşımak için ucun1/5’ini çıkarın. Her grup için yeni bir mikrosantrifüj tüp hazırlayın ve her tüpe 200 μL 1x PBS ekleyin. Bu ikinci tüp son DLM hazırlıktoplamak için kullanılacaktır. Pasteur pipeti kullanarak tüm 1x PBS’yi tüplerden çıkarın. Uygun koruyucu ekipman giyen, kriyojenik cımbız ile 10 s için sıvı azot şişesi içine tüp batırın.NOT: Tüplerin patlamasını engellemek için tüpler sıkıca kapatılmalıdır. Tüpü sıvı nitrojenden çıkarın ve pasteur pipetli numunelere yaklaşık 300 μL buz gibi 1x PBS ekleyin. Örnekleri buzda tut. Silikon elastomer le kaplanmış 10 cm’lik diseksiyon kabına buz gibi 1x PBS ekleyin ve modifiye edilmiş 200 μL pipetle ilk toraksı dağıtın. Toraks ventral tarafını yukarı yerleştirin. Bir yandan toraks konumlandırmak için forseps donuk bir çift kullanın ve diğer toraks orta hattı ortaya çıkarmak için torasik ganglion bazı kaldırmak için forseps ince bir çift kullanın. Bıçak ile toraksın1/3’ünde sığ bir kesim yapmak için toraksın orta çizgisini kılavuz olarak kullanın. Bıçağı torakstan çıkarın ve toraksı künt forceplarla 45° açıyla konumlandırın. Bıçağı tekrar takın ve toraksın orta çizgisini kesin. Bu iki hemithoraces neden olacaktır. Bir seferde bir hemithorax alın ve DLM kas lifi F altında aşırı doku kaldırmak (Şekil 1B), en ventral lif. DLM’lere zarar vermeden fazla dokuyu çıkarmak için bir veya iki kesim yapmak için bıçağı dikkatlice kullanın. İzole olduktan sonra hemithorax’ı 1x PBS ile doğru tüpe aktarın. Tekrar adımları 4.6\u20124.14 kadar 10 grup başına diseksiyon hemithoraces yapılır. 5. Yapısal boyama Toraks örneklerini ikiye kaldıktan sonra, dokuyu bloke edici tampona yerleştirin (%0.1 normal keçi serumu ile 1x PBS ve pH 7.4’te %0.2 Triton X-100) dokuyu permeabilize edin ve spesifik olmayan lekelenmeyi önleyin. Fazla 1x PBS’yi kaldırmak ve her tüpe 1,5 mL engelleme tamponu eklemek için pasteur pipeti kullanın. 4 °C’de en az 1 saat boyunca dokuları bloke edin. Bir floresan konjuge antikor kullanarak yapısal boyama için örnekleri hazırlamak, horseradish peroksidaz 488 (anti-HRP-488) bir seyreltme 1:200 ve Phalloidin-647 bir seyreltme 1:1000 bir seyreltme motor nöronlar ve kas dokusu leke tampon, sırasıyla. Tüp başına 150 μL olacak kadar leke yapın. Lekeyi folyoyla kaplı 4 °C’de veya lekelenmeye hazır olana kadar koyu bir kutuda saklayın. Bloke ettikten sonra, aşırı engelleme tamponunu cam pasteur pipetiyle çıkarın. Yapısal lekedağıtmadan önce, lekegirdirin. Her tüpe 150 μL leke ekleyin. Örnekleri oda sıcaklığında 2 saat boyunca dönerin üzerinde koyu bir kutuya yerleştirin. Lekeyi çıkarın ve koyu bir kutuda rotator üzerinde 5 dakika için% 0,3 Triton X-100% ile oda temp 1x PBS 1,5 mL dokuları dört kez yıkayın. Örnekler artık bir slayta monte etmeye hazır. 6. Montaj dokusu PBST’deki örnekleri yıkadıktan sonra, dokuların boyanması için bir mikroskop slaytı hazırlayın. Cam kapak fişleri, P200 pipet, 200 μL pipet uçları, makas, net takviyeler, düz kenar forceps, anti-fade floresan montaj ortamı, oje ve slaytları kapsayacak şekilde koyu bir kutu dahil olmak üzere ek sarf malzemeleri hazırlayın. Örnekleri tanımlamak için slaydı etiketleyin ve leke olmadığından emin olmak için slaydın kimwipes ile temizleyin. Hemithorax örneklerinin kapak kaymasından zarar görmemesini sağlamak için takviye etiketleri kullanarak bir “köprü” oluşturun. Bir takviye etiketi alın, ikiye bölün ve her yarısını yaklaşık 15 mm arayla yerleştirin. Bu mesafe kapak fişinin genişliğinden daha küçük olmalıdır. 5 etiket yüksekliğinde bir “köprü” tamamlamak için bu adımı dört kez tekrarlayın. P200 pipetini alın ve numuneleri slayta aktarmak için ucun1/5’ini keserek bir ucu değiştirin. Örnekler köprünün ortasındaki slayta aktarılmalıdır. Bir laboratuar silme kenarına alın ve herhangi bir fazla PBST kaldırın. Forceps kullanarak, tüm örnekler kas tarafı yukarı ve cuticle tarafı aşağı karşı karşıya olduğu gibi DLMs düzenleyin. Standart bir P200 pipet ucu kullanarak, hava kabarcıklarından kaçınarak slayta 70 μL montaj ortamı uygulayın. Dışarıdan merkeze başlayan takviyeler içinde dairesel bir desen medya dağıtın. Takviye lerin üzerine bir kapak fişi yerleştirin. Kapak kapağının çevresindeki dış kenarları kaplamak için oje kullanın. Doku tam bir mühür oluşturmak için cömertçe uygulayın. En az 10 dakika kurumasını ve fotoğraf beyazlatma veya floresan kaybını önlemesini sağlayarak skalıcı karanlıkta düz bir yüzeye yerleştirin. Slaytlar artık hemen görüntüleme için kullanılabilir veya daha sonra görüntülemek için -20 °C’deki bir slayt klasöründe depolanabilir. 7. Alternatif: Primer antikorlarla boyama NOT: Bu bölüm isteğe bağlıdır ve istenirse doğrudan 4 ve 5 numaralı bölümler arasında kullanılmalıdır. Primer antikorlar ile doku leke için, en az 1 saat için tampon engelleme doku batırın. Tampon engelleme uygun seyreltme ile birincil antikor hazırlayın. En azından, grup başına 150 μL olacak kadar antikor karışımı hazırlayın. Örneklerin hareketsiz tutulduğunu unutmayın. Kullanıma hazır olana kadar 4 °C’de saklayın. Pasteur pipetiyle fazla engelleme tamponunu kaldırın. Kısaca birincil antikor girdap ve her gruba 150 μL antikor karışımı ekleyin ve 4 ° C gecede örnekleri yerleştirin. Ertesi gün, primer antikor çıkarın ve bir rotator her 5 dakika için PBST ile 4 kez doku yıkayın. Engelleme tamponunda ikincil leke hazırlayın. İkincil lekeyi numuneye ekleyin ve rotator üzerindeki koyu bir kutuda 2 saat oda sıcaklığında tutun.NOT: İkincil boyama da HRP ve phalloidin içerebilir. 2 saat kuluçka sonra, ikincil leke yıkama doku kaldırmak için 4 kez PBST ile 5 dakika ve montaj devam edin.