神経変性と関連した成人 ショウジョウバエ におけるシナプス変性の可視化

トランスジェニックハエの発生 この実験のためにトランスジェニックハエを生成するには、OK371-Gal425処女雌ハエとUAS-TDP-43M337V 26の雄を集め、パッド上のCO2でハエを麻酔して並べ替えます。 十字架のための標準的なショウジョウバエ媒体とバイアルに麻酔をしたハエを並べ替えます。次世代が出現するために25°Cでバイアルのラベルを付けます。注:適切な遺伝子型を確保するために子孫が出現する前にバイアルから大人をクリアします。 子孫が出現したら、トランスジェニックハエをバイアルに集め、セックスで並べ替え、実験条件の老化を開始します。 ハエが集まったら、ハエが生後21日になるまで2日ごとに生鮮食品に移ります。 2. 解剖準備 解剖の準備のために、室温リン酸緩衝生理食塩水(1x PBS)、シリコンエラストマーでコーティングされた10cmの解剖皿を得て、 ストレートエッジ解剖用はさみ、鈍解解鉗子の1セット、P200ピペットとピペットチップ、2.0 mLマイクロ遠心分離チューブ、標準的なオフィスハサミ、70%エタノール、6cmペトリ皿、および32%ホルムアルデヒドを1x PBSで4%に希釈した。 各遺伝子型または条件にラベルチューブを使用し、各チューブに900 μLの1x PBS(室温)と32%ホルムアルデヒド150 μLを加えます。4%ホルムアルデヒド固定剤を準備する際は、手袋と安全メガネを着用してください。 6\u201210は、CO2 とバイアルから直接グループごとにハエを麻酔し、70%エタノールで6cmのペトリ皿に飛びます。プレスは、試料が完全に水没していることを確認するために、ペイントブラシを使用してエタノールに飛びます。これは、外側のキューティクルの油の層を削除します。 3. 胸郭の分離と固定 各標本を解剖する前に、約7\u201210 mLの1x PBSをシリコーンエラストマーでコーティングされた解剖皿に加えます。この容積はティッシュサンプルが完全に水没することを保障するべきである。 鈍い鉗子を使用して、翼または脚のいずれかを握り、70%エタノールから解剖皿に1つのハエを移します。 解剖顕微鏡の下で解剖皿のサンプルを焦点を合わせます。次に、サンプルを1x PBSに沈め、鈍いデュモン#5細かい鉗子を使用して翼を慎重に取り除きます。 Vannasストレートエッジスプリング解剖はさみを使用して、キューティクルの腹側に小さな切開を作成することによって脚を取り除きます。ステップ3.8では、この切開はホルムアルデヒドが組織に浸透することを可能にする。 ハサミを片手に持ち、もう一方の手で鉗子を持ってフライ腹側を上に置きます。鈍い鉗子で標本を所定の位置に保持しながら、解剖はさみで頭と腹部を取り除きます。 ステップ3.2から、変更されたピペットチップを使用して分離された胸郭をラベル付きチューブに移します。注:固定液に余分な1x PBSを追加しないようにピペットを40 μLに設定します。 各標本について、上記の手順 3.2\u20123.6 を繰り返します。 室温で30分間サンプルを固定します。 パスツールピペットを使用して修正を取り除き、ヒュームフードの下の適切な廃棄物容器に捨てます。パスツールピペットを使用して、それぞれ1.5 mLの1x PBSで3回サンプルをすすいでください。わずか750 μLで4回目のすすを完成させ、1x PBSに組織を残します。注:この時点で、組織サンプルは、次のステップに進む前に、最大3日間4°Cに留まることができます。 4. フラッシュ凍結と胸郭二分 二項を開始する前に、適切な凍結保護手袋と安全眼鏡を着用した液体窒素でデュワーフラスコを満たしてください。ブレードブレーカ、羽根刃、細かい鉗子、氷、氷冷1x PBS、極低温ピンセットを1足取ります。 1倍のPBSを冷たく保つためにアイスバケツを準備します。 ブレードブレーカを使用して羽根を斜めにつかみ、ブレードを曲げて小片を壊します。ブレードブレーカは、小さなメスとして使用するためにブレードを所定の位置にロックすることができます。注: すべてのグループに対して 1 つのブレードが必要です。ブレードが壊れたり、鈍くなったりした場合に切り替えます。 P200にきれいなピペットチップを加え、サンプルを輸送するために先端の1/5分の1を 取り除きます。 各グループに新しいマイクロ遠心チューブを用意し、各チューブに200 μLの1x PBSを加えます。この2番目のチューブは、最終的なDLM準備を収集するために使用されます。 パスツールピペットを使用してチューブからすべての1x PBSを取り除く。 適切な保護具を着用し、極低温ピンセットで10 sの液体窒素フラスコにチューブを沈めます。注:チューブが爆発しないようにチューブをしっかりと閉じる必要があります。 液体窒素からチューブを取り出し、約300 μLの氷冷1x PBSをパスツールピペットでサンプルに加えます。サンプルを氷の上に置いておきなさい。 シリコンエラストマーでコーティングされた10 cmの解剖皿に氷冷1x PBSを加え、変更された200 μLピペットで最初の胸郭を分配します。 胸部腹側を上に置きます。一方では、鈍い鉗子を使用して胸郭を配置し、もう一方では細かい鉗子を使用して胸郭の正中線を露出させるために胸郭神経節の一部を取り除きます。 胸郭の正中線をガイドとして使用して、胸郭の1/3rdをブレードrdで浅く切り抜けます。 胸郭からブレードを取り外し、鈍い鉗子で45°の角度で胸郭を配置します。ブレードを再挿入し、胸郭の正中線をまっすぐに切ります。これは2つのヘミトレースになります。 一度に1つのヘミトラックスを取り、DLM筋線維F(図1B)、最も腹側繊維の下で余分な組織を除去する。ブレードを使用して、1つまたは2つのカットを慎重に行い、DVMを損傷することなく余分な組織を取り除きます。 分離したら、1x PBSで正しいチューブにヘミトラックスを移します。 グループごとに10の解剖されたヘミトレースが作られるまで、ステップ4.6\u20124.14を繰り返します。 5. 構造染色 胸郭サンプルを二分した後、組織をブロッキングバッファー(1x PBSは通常のヤギ血清0.1%、トリトンX-100はpH7.4)に入れて組織を透過させ、非特異的な染色を防ぎます。パスツールピペットを使用して余分な1x PBSを除去し、各チューブに1.5mLのブロッキングバッファーを追加します。4°Cで少なくとも1時間の組織をブロックする。 蛍光結合抗体、西洋ワサビペルオキシダーゼ488(抗HRP-488)を希釈して1:200、ファロイジン-647をそれぞれ1:1000の希釈で、運動ニューロンと筋肉組織を染色するためのブロッキングバッファーで、構造染色用サンプルを調製します。チューブあたり150 μLを持つのに十分な汚れを作ります。汚れを汚す準備ができるまで、ホイルで覆われた4°Cまたは暗い箱に汚れを保管してください。 ブロッキング後、ガラスパスツールピペットで余分なブロッキングバッファーを除去します。 構造染色を分配する前に、汚れを渦液にする。各チューブに150μLの汚れを加えます。サンプルを室温で、回転器の暗い箱に2時間置きます。 汚れを取り除き、暗い箱のローテーターで5分間0.3%トリトンX-100で部屋温度1x PBSの1.5 mLでティッシュを4回洗います。サンプルをスライドにマウントする準備ができました。 6. 取り付けティッシュ PBSTでサンプルを洗浄した後、顕微鏡スライドを調製し、染色用のティッシュを取り付けます。ガラスカバースリップ、P200ピペット、200 μLピペットチップ、はさみ、透明な補強、ストレートエッジ鉗子、アンチフェード蛍光実装メディア、マニキュア、およびスライドを覆うダークボックスを含む追加の供給を準備します。 スライドにラベルを付けてサンプルを識別し、スライドをスキミをクリーニングして、汚れがないようにします。 カバースリップでヘミトホラックスのサンプルが破損しないように、補強ラベルを使用して「ブリッジ」を構築します。補強ラベルを1枚取り、半分に切り、各半分を約15mm離します。この距離は、カバースリップの幅よりも小さくなければなりません。この手順を 4 回繰り返して、5 つのラベルの高い「ブリッジ」を完了します。 P200ピペットを取り、サンプルをスライドに移すために先端の1/5番目 を切り落とすことによって先端を修正します。サンプルはブリッジの中央のスライドに移す必要があります。 ラボワイプの端を取り、余分なPBSTを取り除きます。鉗子を使用して、すべてのサンプルが筋肉側を上向きにし、キューティクル側を下に向けになるようにDDLを配置します。 標準的なP200ピペットチップを使用して、70 μLの取り付けメディアをスライドに塗布し、気泡を避けます。メディアを外側から中心に向けて、援軍の内側の円形パターンで分配します。 補強材の上にカバースリップを置きます。 マニキュアを使用して、カバースリップの周囲の外側の端をコーティングします。組織の完全なシールを形成するために寛大に適用します。 スライドを暗闇の中で平らな表面に置き、少なくとも10分で乾燥させ、光の漂白や蛍光の損失を防ぎます。スライドは、すぐにイメージングに使用したり、後で見たりするために-20°Cのスライドフォルダに保存したりすることができます。 7. 代替: 一次抗体で染色する 注: このセクションは オプション で、必要に応じてセクション 4 と 5 の間で直接使用する必要があります。 一次抗体で組織を染色するには、少なくとも1時間ブロッキング緩衝液中の組織を沈下する。 ブロッキングバッファーに適切な希釈を備えた一次抗体を調製します。少なくとも、グループあたり150 μLを持つ十分な抗体混合物を調製してください。サンプルはそのまま保持されることに注意してください。4°Cで使用できる状態になるまで保管してください。 パスツールピペットで余分なブロッキングバッファーを除去します。一次抗体を簡単にボルテックスし、各群に150 μLの抗体混合物を加え、一晩4°Cでサンプルを配置します。 翌日、一次抗体を取り除き、PBSTで4回、回転器で5分間洗浄します。 ブロッキングバッファーに二次染色を準備します。サンプルに二次染色を加え、回転器の暗い箱の中で2時間室温に保ちます。注:二次染色はまたHRPおよびファロイドンを含むことができる。 2hインキュベーション後、PBSTで5分間洗浄した組織を4回除去し、装着に進む。