הדמיה ניוון סינפטי ב דרוזופילה למבוגרים בשיתוף עם ניוון עצבי

1. דור זבובים טרנסגנים כדי ליצור זבובים טרנסגניים לניסוי זה, לאסוף OK371-Gal425 זבובים נקבה בתולה וזכרים של UAS-TDP-43M337V 26 (איור 1A) על ידי זבוביםמסטימים עם CO 2 על משטח למיין. מיין זבובים מרדים לתוך בקבוקונים עם מדיה Drosophila סטנדרטית עבור הצלב. מקום בקבוקונים עם תווית ב 25 °C עבור הדור הבא להגיח.הערה: נקה את המבוגרים מהקלעונים לפני שהצולה תצא כדי להבטיח את הגנוטיפ הנכון. ברגע שצאים מגיחים, אספו את הזבובים הטרנסגניים לתוך בקבוקונים ומיין לפי מין כדי להתחיל להזדקן לתנאים ניסיוניים. לאחר איסוף הזבובים, מעבירים זבובים למזון טרי כל יומיים עד שהזבובים בני 21 ימים. 2. הכנה לפירוק כדי להתכונן לנתחים, להשיג תמיסת מלח פוספט בטמפרטורת החדר (1 x PBS), צלחת 10 ס”מ מצופה אלסטומר סיליקון, קצוות ישרים לנתח מספריים, קבוצה אחת של מפסים קהים, P200 פיפטה וטיפים פיפטה, 2.0 מ”ל צינורות microcentrifuge, מספריים משרדיים סטנדרטיים, 70% אתנול, צלחת פטרי 6 ס”מ, ו 32% פורמלדהיד מדולל 4% עם PBS 1x. צינורות תווית עבור כל גנוטיפ או מצב ולהוסיף 900 μL של 1x PBS (חדר זמני) ו 150 μL של 32% פורמלדהיד לכל שפופרת. ללבוש כפפות ומשקפיים בטיחות בעת הכנת 4% פורמלדהיד קיבעון. מבריש 6\u201210 זבובים לכל קבוצה ישירות מהמבעון עם CO2 ולשקוע זבובים לתוך צלחת פטרי 6 ס”מ עם 70% אתנול. לחץ עף למטה לתוך האתנול באמצעות מברשת צבע כדי להבטיח כי דגימות שקועות לחלוטין. זה יסיר את שכבת השמן על העורון החיצוני. 3. בידוד בית החזה וקביבעון לפני לנתח כל דגימה, להוסיף כ 7\u201210 מ”ל של 1x PBS לצלחת הניתוח מצופה אלסטומר סיליקון. אמצעי אחסון זה אמור להבטיח כי דגימות הרקמה שקועות לחלוטין. מעבירים זבוב אחד לצלחת החתכים מ-70% אתנול באמצעות ממחלצות קהות ואוחזים בכנפיים או ברגליים. למקד את הדגימה בצלחת הקטע תחת מיקרוסקופ לנתח. לאחר מכן לשקוע הדגימה 1x PBS, בזהירות להסיר את הכנפיים באמצעות דומונט בוטה #5 משקולות עדינות. באמצעות Vannas קצה ישר חיתוך האביב מספריים, להסיר את הרגליים על ידי יצירת חתך קטן בצד הגיאנל של צינור. בשלב 3.8, חתך זה יאפשר לפורמלדהיד לחדור את הרקמה. קח את המספריים ביד אחת והחזק את המקרנים ביד השנייה כדי למקם את הצד הפתחי של הזבוב למעלה. תוך החזקת הדגימה במקום עם הממחצות הקהות, הסר את הראש והבטן עם המספריים. העבר את בית החזה המבודד באמצעות קצה פיפטה ששונה לתוך הצינור המסומן, ממדרגה 3.2.הערה: הגדר את הפיפטה ל- 40 μL כדי להימנע מהוספת PBS 1x נוסף ל- fixative. חזור על שלבים 3.2\u20123.6 לעיל עבור כל דגימה. תקן דגימות במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. הסר את התיקון באמצעות פיפטת פסטר וזרוק אותו במיכל הפסולת המתאים מתחת למכסה האדים. לשטוף דגימות שלוש פעמים עם 1.5 מ”ל של 1x PBS כל באמצעות פיפטה פסטר. להשלים שטיפה רביעית באמצעות רק 750 μL ולהשאיר טישו 1x PBS.הערה: בשלב זה, דגימות רקמה יכולות להישאר ב- 4 °C עד 3 ימים לפני שתמשיך לשלבים הבאים. 4. הקפאת הבזק וריסטורי בית החזה לפני תחילת הקטעים, מלאו בקבוקון Dewar בחנקן נוזלי עם כפפות מגן הקפאה מתאימות ומשקפיים בטיחותיים. להשיג מפסק להב, להבי נוצות, זוג אחד של מפסים עדינים, קרח, קר כקרח 1x PBS, פינצטה cryogenic. הכינו דלי קרח כדי לשמור על 1 pBS קר כקרח. השתמש במפסק הלהב כדי לתפוס את להב הנוצה בזווית, ולכופף את הלהב כדי לשבור חתיכה קטנה. מפסק הלהב יכול לנעול את הלהב בעמדה לשימוש כאזמל קטן.הערה: להב אחד אמור להימשך עבור כל הקבוצות. החלף אם להב נשבר או הופך למשעמם. הוסף קצה פיפטה נקי P200 ולהסיר 1/5th של הקצה כדי להעביר דגימות. להכין צינור microcentrifuge חדש עבור כל קבוצה ולהוסיף 200 μL של 1x PBS לכל שפופרת. הצינור השני הזה ישמש לאיסוף ההכנות הסופיות של DLM. הסר את כל 1x PBS מצינורות באמצעות פיפטה פסטר. לובש ציוד מגן נכון, לשקוע הצינור לתוך בקבוקון חנקן נוזלי עבור 10 s עם פינצטה cryogenic.הערה: הצינורות צריכים להיות סגורים בחוזקה כדי למנוע את הצינור מתפוצץ. הסר את הצינור מהחנקן הנוזלי ולהוסיף כ 300 μL של כקרח קר 1x PBS לדגימות עם פיפטה פסטר. שמור את הדגימות על קרח. הוסף PBS 1x קר כקרח לצלחת 10 ס”מ פירוק מצופה אלסטומר סיליקון ולחלק את בית החזה הראשון עם 200 μL pipette שונה. מקם את צד החזה למעלה. ביד אחת להשתמש זוג משעמם של מלקות כדי למקם את בית החזה וביד השנייה להשתמש זוג מלקות בסדר כדי להסיר חלק גנגוליון בית החזה כדי לחשוף את קו האמצע של בית החזה. השתמש בקו האמצע של בית החזה כמדריך כדי לבצע חתך רדוד דרך 1/3rd של בית החזה עם הלהב. הסר את הלהב מבית החזה ומקם את בית החזה בזווית של 45 מעלות עם המנוריים הקהים. הכנס מחדש את הלהב וחתוך ישר את קו האמצע של בית החזה. זה יגרום לשני המיטוראס. קח המיטוהורקס אחד בכל פעם ולהסיר את הרקמה העודפת תחת סיבי שריר DLM F(איור 1B),הסיבים האווריריים ביותר. השתמש בלהב כדי לבצע בזהירות חתכ אחד או שניים כדי להסיר את הרקמה העודפת מבלי לפגוע ב- DLMs. לאחר בידוד, להעביר את המיטוהרקס לצינור הנכון עם PBS 1x. חזור על שלבים 4.6\u20124.14 עד 10 hemithoraces לנתח לכל קבוצה נעשות. 5. כתמים מבניים לאחר תוחם את דגימות בית החזה, מקם את הרקמה במאגר חסימה (PBS אחד עם סרום עזים רגיל של 0.1% ו-0.2% Triton X-100 ב-pH 7.4) כדי לחלחל לרקמה ולמנוע כתמים לא ספציפיים. השתמש בפיפטה פסטר כדי להסיר עודף 1x PBS ולהוסיף 1.5 מ”ל של מאגר חסימה לכל שפופרת. לחסום טישו לפחות 1 שעה ב 4 ° C. להכין את הדגימות עבור כתמים מבניים באמצעות נוגדן פלואורסצנטית, חזרת peroxidase 488 (אנטי HRP-488) תוך דילול של 1:200 ו Phalloidin-647 תוך דילול של 1:1000 בחסימת מאגר כדי להכתים נוירונים מוטוריים ורקמות שריר, בהתאמה. לעשות מספיק כתם יש 150 μL לכל שפופרת. לאחסן את הכתם ב 4 מעלות צלזיוס מכוסה בנייר כסף או בקופסה כהה עד מוכן לכתמים. לאחר החסימה, הסר את מאגר החסימה העודף עם פיפטת פסטר זכוכית. לפני חלוקת הכתם המבני, מערבולת הכתם. להוסיף 150 μL של הכתם לכל שפופרת. מניחים את הדגימות בקופסה כהה על המסובב בטמפרטורת החדר למשך 2 שעות. הסר את הכתם ולשטוף את הרקמות ארבע פעמים ב 1.5 מ”ל של חדר temp 1x PBS עם 0.3% Triton X-100 במשך 5 דקות על המסובב בקופסה כהה. הדגימות מוכנות כעת להטענה לשקופית. 6. רקמת הרכבה לאחר שטיפת דגימות PBST, להכין שקופית מיקרוסקופ כדי הר רקמה לכתמים. הכן אספקה נוספת כולל תלושי כיסוי זכוכית, פיפטה P200, 200 μL פיפטה טיפים, מספריים, תגבורת ברורה, מלקות קצה ישר, אנטי עמעום פלורסנט הרכבה מדיה, לק, ותיבה כהה כדי לכסות את השקופיות. תייג את השקופית כדי לזהות את הדגימות ולנקות את השקופית באמצעות קימוויפ כדי לוודא שאין כתמים. כדי להבטיח שדגימות ההמיטהורקס לא יינזקו על-ידי תעודת הכיסוי, בנה “גשר” באמצעות תוויות חיזוק. לוקחים תווית חיזוק אחת, חותכים אותה לשניים, ומלמקם כל חצי כ-15 מ”מ זה מזה. מרחק זה חייב להיות קטן יותר מרוחב תעודת הכיסוי. חזור על שלב זה ארבע פעמים כדי להשלים “גשר” בגובה 5 תוויות. קח את הפיפטה P200 ולשנות עצה על ידי חיתוך1/5 th של הקצה כדי להעביר את הדגימות לשקופית. יש להעביר דגימות אל המגלשה במרכז הגשר. קח את הקצה של מחיקת מעבדה ולהסיר כל PBST עודף. באמצעות מקציות, לסדר את DLMs כך שכל הדגימות פונים לצד השריר כלפי מטה וצד הציוף כלפי מטה. באמצעות קצה פיפטה P200 רגיל, להחיל 70 μL של מדיה הרכבה על השקופית, הימנעות בועות אוויר. לחלק את התקשורת בתבנית מעגלית בתוך התגבורת החל מבחוץ למרכז. מניחים תלוש כיסוי מעל התגבורת. השתמש לק לציפוי הקצוות החיצוניים סביב ההיקף של כיסוי. למרוח בנדיבות כדי ליצור חותם מלא של הרקמה. מניחים את המגלשה על משטח שטוח בחושך, ומאפשרים לפחות 10 דקות לייבש ולמנוע הלבנת תמונות או אובדן פלואורסץ. כעת ניתן להשתמש בשקופית להדמיה מיידית, או לאחסן בדרך אחרת בתיקיית שקופיות ב- -20 °C לתצוגה מאוחרת יותר. 7. חלופה: הכתמה עם נוגדנים ראשוניים הערה: סעיף זה הוא אופציונלי ויש להשתמש בו ישירות בין סעיפים 4 ו- 5 אם תרצה. כדי להכתים רקמה עם נוגדנים ראשוניים, לשקוע רקמת חיץ חסימה לפחות 1 שעות. הכן נוגדן ראשי עם דילול נכון בחסימת מאגר. לכל הפחות, להכין מספיק תערובת נוגדנים יש 150 μL לכל קבוצה. שים לב שהדגימות לא נשמרות. יש לאחסן ב-4°C עד להכנה לשימוש. הסר מאגר חסימה עודף באמצעות פיפטה פסטר. מערבולת קצרה הנוגדן הראשי ולהוסיף 150 μL של תערובת נוגדנים לכל קבוצה ולמקם דגימות ב 4 מעלות C לילה. ביום שלמחרת, להסיר נוגדן ראשי ולשטוף רקמת 4 פעמים עם PBST במשך 5 דקות כל אחד על סיבוב. הכן כתמים משניים במאגר חסימה. הוסף את הכתם המשני לדגימה ולאחר מכן לשמור אותו טמפרטורת חדר במשך 2 שעות בתיבה כהה על המסובב.הערה: הכתמים המשניים יכולים לכלול גם HRP ופאלואידין. לאחר הדגירה 2 שעות, כדי להסיר את רקמת לשטוף כתמים משני 4 פעמים במשך 5 דקות עם PBST ולהמשיך הרכבה.