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Bioengineering

Biofuncionalização de Nanomateriais Magnéticos

Published: July 16, 2020
doi:
10.3791/61360
, ,
1Division of Biological and Environmental Sciences and Engineering,King Abdullah University of Science and Technology, 2Division of Computer, Electrical and Mathematical Sciences and Engineering,King Abdullah University of Science and Technology

Summary

Neste trabalho, fornecemos um protocolo para biofuncionalizar nanomateriais magnéticos com anticorpos para direcionamento celular específico. Como exemplos, utilizamos nanofios de ferro para atingir células cancerígenas.

Abstract

Nanomateriais magnéticos têm recebido grande atenção em diferentes aplicações biomédicas. Biofuncionalizar esses nanomateriais com agentes alvo específicos é um aspecto crucial para aumentar sua eficácia em diagnósticos e tratamentos, minimizando os efeitos colaterais. O benefício dos nanomateriais magnéticos em comparação com os não magnéticos é a sua capacidade de responder a campos magnéticos de uma forma livre de contacto e a grandes distâncias. Isso permite guiá-los ou acumulá-los, enquanto eles também podem ser monitorados. Recentemente, nanofios magnéticos (NWs) com características únicas foram desenvolvidos para aplicações biomédicas. O grande momento magnético desses NWs permite um controle remoto mais eficiente de seu movimento por um campo magnético. Isso tem sido utilizado com grande sucesso no tratamento do câncer, liberação de drogas, traçado celular, diferenciação de células-tronco ou ressonância magnética. Além disso, a fabricação de NW por deposição eletroquímica assistida por molde fornece um método versátil com controle rígido sobre as propriedades de NW. Especialmente NWs de ferro e NWs de óxido de ferro-ferro (núcleo-casca) são adequados para aplicações biomédicas, devido à sua alta magnetização e baixa toxicidade.

Neste trabalho, nós fornecemos um método para biofuncionalizar NWs de ferro/óxido de ferro com anticorpos específicos direcionados contra um marcador específico de superfície celular que é superexpresso em um grande número de células cancerosas. Uma vez que o método utiliza as propriedades da superfície do óxido de ferro, ele também é aplicável a nanopartículas superparamagnéticas de óxido de ferro. Os NWs são primeiramente revestidos com 3-aminopropil-tri-etoxi-silano (APTES) atuando como um ligante, ao qual os anticorpos estão ligados covalentemente. O revestimento APTES e a biofuncionalização de anticorpos são comprovados por espectroscopia de perda de energia eletrônica (EELS) e medidas de potencial zeta. Além disso, a antigenicidade dos anticorpos nos NWs é testada usando imunoprecipitação e western blot. O direcionamento específico dos NWs biofuncionalizados e sua biocompatibilidade são estudados por microscopia confocal e ensaio de viabilidade celular.

Introduction

Uma propriedade única dos nanomateriais magnéticos é sua capacidade de responder a campos magnéticos1, que podem ser utilizados beneficamente para atuá-los de muitas maneiras, enquanto eles também podem ser monitorados, por exemplo, por ressonância magnética (RM). Ao aplicarem um campo magnético alternado em alta frequência, podem gerar calor, o que pode induzir hipertermia, fornecendo uma opção terapêutica1. Outra abordagem é o tratamento fototérmico, que pode ser realizado com laser de infravermelho próximo (NIR) 2,3.

Dentre o grande número de nanomateriais magnéticos, o óxido de ferro tem recebido maior atenção em aplicações biológicas como separação magnética, hipertermia2,4, orientação celular5, liberação defármacos 6,7,8 e como agente de contraste em RM 9,10. Isso se deve à sua alta biocompatibilidade 11,12, grande magnetização 11,12, capacidade de serem revestidos 9,13,14,15, capacidade de carrear fármacos 2,16, capacidade de serem funcionalizados com fármacos2,16 e/ou agentes alvo12,13,17,18, e capacidade de converter energia óptica em calor2. Recentemente, o MagForce iniciou ensaios clínicos em pacientes com câncer usando nanopartículas de óxido de ferro para o tratamento da hipertermia19.

Ultimamente, os nanofios magnéticos (NWs) têm sido cada vez mais explorados para aplicações biomédicas3,11,16,20,21,22. Possuem propriedades semelhantes às nanoesferas magnéticas, mas oferecem uma forma anisotrópica e um momento magnético muito grande, o que permite um controle remoto muito eficiente por um campo magnético23,24, incluindo atuação de baixa frequência para induzir efeitos magnetomecânicos 25,26,27,28,29. Como consequência, os NWs têm sido implementados para diferentes aplicações biológicas, tais como isolamento de exossomos30 rastreamento celular 21, tratamento de câncer 3,11,16, liberação de drogas 16,31,32 e como agente de contraste para RM 33.

Nanomateriais magnéticos biofuncionalizados com capacidade específica de segmentação celular têm grande potencial para aplicações biomédicas e em medicina de precisão34,35. Para fixar esses agentes de ataque, é necessária uma modificação de superfície nos nanomateriais. Normalmente, eles precisam de um revestimento que forneça um grupo funcional, o que facilita a fixação dos agentes de tratamento. Na literatura, há um grande número de revestimentos orgânicos e inorgânicos para nanomateriais magnéticos. Com base no grupo funcional que pode ser imobilizado ao nanomaterial, esses revestimentos podem ser categorizados em quatro grupos principais: moléculas baseadas em grupos ácido carboxílico, polímeros, histidina e moléculas baseadas em grupos silano.

A base de moléculas em grupos ácidos carboxílicos é um dos métodos de modificação de superfície. Utiliza a alta afinidade
entre o grupo ácido carboxílico negativo no revestimento e a carga positiva nos nanomateriais magnéticos36,37,38. O processo de ligação de um ácido carboxílico a uma superfície metálica pode envolver a geração de sais metal-carboxilato ou a adesão do grupo carboxila ao metal. No entanto, para NWs multissegmentados, como os NWs de ferro/ouro ou níquel/ouro, que apresentam excelentes propriedades para bioaplicações39,40, esse tipo de revestimento não pode ser aplicado facilmente. Requer dois revestimentos diferentes ao mesmo tempo: grupos tióis para modificar os segmentos de ouro e grupos carboxila para segmentos magnéticos (ferro ou níquel)38. Alguns exemplos de moléculas baseadas em grupos carboxila são a hematoporfirina, o ácido pimérico, o ácido palmítico e o ácido 3-[(2-aminoetil) ditio] propiônico (PEEDA)38. Modificações superficiais de nanomateriais magnéticos usando polímeros oferecem algumas vantagens distintas. Devido ao grande peso molecular dos polímeros, aumenta a estabilidade do nanomaterial magnético em uma solução38. No entanto, aumentará significativamente o tamanho do nanomaterial38. Polivinilpirrolidona (PVP), polietilenoimina (PEI), ácido aspártico arginina-glicina-D (RGD) e polietilenoglicol (PEG) são alguns exemplos dos polímeros mais comumente usados para modificações de superfície. Cada um tem suas características e usa38. O terceiro método de modificação de superfície é usando um revestimento de histidina. A histidina é uma proteína com uma cadeia lateral de aminoácidos histidina que tem uma alta afinidade por um número limitado de nanomateriais magnéticos, como o níquel38. Pode ser empregada em processos de purificação de proteínas 38,41,42. Um revestimento de histidina também pode ser aplicado a NWs multissegmentados, como NWs de níquel/ouro38. A silanização da superfície de um nanomaterial é um processo bem estabelecido 38,43,44. Baseia-se em um átomo de silício ligado a qualquer superfície de óxido metálico através de três ligações simples, e ao mesmo tempo este átomo de silício está se ligando ao grupo funcional na extremidade através de uma cadeia alquila 38,43,44. A vantagem desse revestimento é fornecer grupos aminas livres, e tem a capacidade de revestir materiais magnéticos e não magnéticos38,45, como níquel e ouro, respectivamente. Portanto, o uso de moléculas baseadas no grupo salino é uma rota prática para biofuncionalizar NWs multissegmentados. Alguns exemplos de moléculas baseadas em grupos silanos são o (3-aminopropil) trietoxisilano (APTES) e o (3-aminopropil) trimetoxissilano (APTMS)38,45.

A adição de um agente alvo ao revestimento pode desempenhar um papel significativo tanto no diagnóstico quanto no tratamento de células doentes e, ao mesmo tempo, minimizar os efeitos colaterais em tecidos saudáveis46,47. A adição de um agente alvo na superfície dos nanomateriais aumenta tanto a ligação seletiva celular quanto a internalização por meio de receptores de endocitose7. Sem esses ligantes-alvo, os nanomateriais interagem de forma não específica com as membranas celulares, que se ligam a uma taxa menor em comparação com os nanomateriais com os ligantes48. Um dos desafios de atingir tecidos cancerosos é a sua semelhança característica com tecidos saudáveis. Portanto, o sucesso do direcionamento depende principalmente da determinação do ligante apropriado para uso como alvo biológico 49,50. Vários agentes de direcionamento têm sido empregados para direcionar nanomateriais para células cancerosas48,51 (por exemplo, CD44, devido à sua alta expressão em células cancerosas em comparação com células saudáveis52,53,54,55).

Os agentes de segmentação podem ser categorizados em três grupos principais, com base nos componentes de que são feitos e em sua complexidade: segmentação baseada em aptâmero, direcionamento baseado em ligantes e direcionamento baseado em anticorpos. Os aptâmeros são fitas curtas de DNA ou RNA-oligonucleotídeos sintetizadas quimicamente que são dobradas em estruturas bidimensionais e tridimensionais, tornando-as capazes de atingir um antígeno específico, na maioria das vezes proteínas56. O direcionamento baseado em ligantes inclui peptídeos e cadeias curtas de aminoácidos57. A segmentação baseada em anticorpos envolve o uso de um anticorpo inteiro ou fragmentos de anticorpos, como fragmentos variáveis de cadeia única ou fragmentos de ligação a antígenos51. O uso desse método tem a vantagem de possuir dois sítios de ligação com alta afinidade de ligação ao seu antígeno-alvo específico, o que lhe confere uma seletividade extremamente alta58. Os sítios de ligação são análogos a uma fechadura e o antígeno a uma chave58.

Neste trabalho, os NWs utilizados foram confeccionados por eletrodeposição sobre membranas de óxido de alumínio, método descrito em detalhes em publicaçãoanterior59. O foco aqui, é liberar esses NWs de óxido de ferro-ferro (núcleo-casca) das membranas e biofuncionalizá-los com anticorpos específicos para fornecer uma capacidade de alvo. Os anticorpos não podem se ligar diretamente aos NWs de óxido de ferro-ferro e requerem um ligante. O revestimento dos NWs com APTES fornece grupos amina livres, permitindo a fixação covalente via grupo carboxila nos anticorpos (Figura 1). A vantagem do revestimento APTES é sua capacidade de trabalhar para materiais magnéticos21 e não magnéticos60 , como ferro/ouro ou níquel/ouro NWs45. Todas as etapas de revestimento e biofuncionalização explicadas neste protocolo podem ser utilizadas com qualquer nanomaterial ferro/óxido de ferro, em geral. NWs ferro/óxido de ferro foram usados aqui como exemplo. Os resultados mostram que os NWs funcionalizados com anticorpos possuem alta antigenicidade para receptores específicos de superfície celular, que podem ser utilizados para diferentes aplicações. Exemplos incluem separação celular, liberação de drogas, tratamento específico de células cancerígenas usando tratamentos fototérmicos e/ou magnetomecânicos.

Protocol

CUIDADO: Consulte sempre todas as fichas de dados de segurança de materiais (FISPQ) relevantes antes de usar. Use todas as práticas de segurança adequadas e equipamentos de proteção individual (óculos de segurança, luvas, jaleco, calça comprida, sapatos fechados). Realizar todas as reações biológicas no exaustor biológico. NOTA: Este protocolo destina-se a produzir 2 x 10 10 NWs/mL biofuncionalizados equivalentes a 0,36 mg de ferro/mL revestidos com anticorpos anti-CD44 com uma densidade de 3 x10 4 anticorpos/NW. Os NWs de óxido ferro-ferro (núcleo-casca) têm 2,5 μm de comprimento e diâmetro de 41,5 nm. 1. Liberação de nanofios de ferro NOTA: O processo de fabricação dos NWs ferro/óxido de ferro foi explicado em detalhes em uma publicação anterior59. Em uma esteira de corte, corte os discos de alumínio (Al) (Figura 2A) em pequenos pedaços (Figura 2B) usando uma lâmina de borda única e um martelo pequeno para encaixar em um tubo de 2 mL. Use uma pinça para transferir as pequenas peças de Al para o tubo. Preencher o tubo de 2 mL, contendo os pequenos pedaços de Al, com 1 mL de hidróxido de sódio (NaOH) 1 M. Certifique-se de que todas as peças de Al estão cobertas com o NaOH. Deixe a solução a funcionar durante 30 minutos à temperatura ambiente dentro de um exaustor de fumos químicos. Remova apenas as peças de Al usando a pinça e mantenha os NWs liberados (clusters pretos, Figura 3A) na solução de NaOH por mais 30 min. Não altere a solução de NaOH. Recolher os NWs colocando o tubo de 2 ml num rack magnético e aguardar 2 minutos antes de remover a solução antiga de NaOH 1 M. Substitua-o por solução fresca de NaOH. Sonicar o tubo de 2 mL contendo os NWs por 30 s e deixá-lo por 1 h dentro de um exaustor de fumaça química. Repita as etapas 1.5-1.6 pelo menos quatro vezes. Lave os NWs colocando o tubo de 2 mL no rack magnético e aguarde 2 min. Eliminar a solução de NaOH e substituí-la por 1 ml de etanol absoluto. Sonicate o tubo por 30 s. Coloque o tubo de 2 mL no rack magnético e aguarde 2 min. Descarte a solução antiga de etanol absoluto e substitua-a por 1 mL de etanol absoluto fresco e sonicate por 30 s. Repita as etapas 1.11 e 1.12 por pelo menos quatro vezes. Manter os NWs em 1 mL de etanol absoluto à temperatura ambiente até que sejam necessários. Medir a concentração de ferro e, portanto, os NWs usando espectrometria de massa com plasma indutivamente acoplado (ICP-MS).NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui. No entanto, para armazenamento de longo prazo, não libere os NWs do modelo Al até que seja necessário. Manter os NWs liberados precipitando no etanol por um longo tempo sem sonicação frequente criará agregações que precisarão de tempos mais longos de sonicação para serem separadas. 2. Revestimento dos nanofios com APTES NOTA: Neste protocolo, 100 μL de solução de APTES (densidade de 0,946 g/mL61) é suficiente para revestir 1,6 x 107 m2/g de NWs. Se se verificar uma alteração do rácio ou da massa do nanomaterial, o volume APTES deve ser ajustado em conformidade. Transfira os NWs da etapa 1.14 para um tubo de vidro de 5 mL usando uma pipeta de 1 mL. Para coletar os NWs deixados no tubo de 2 mL, lave o tubo vazio de 2 mL duas vezes adicionando 1 mL de etanol absoluto e transfira-o para o tubo de vidro de 5 mL usando uma pipeta de 1 mL. Usando a pipeta, pegue 100 μL de APTES e adicione-o diretamente à solução NW. Vórtice o tubo de vidro de 5 mL por 10 s. Ajuste o tubo de vidro de 5 mL na braçadeira de um suporte de retorta de laboratório. Coloque metade do tubo de vidro de 5 mL dentro da água do banho ultrassônico e sonicate por 1 h. Retirar o tubo de vidro de 5 mL do banho ultrassônico e adicionar 400 μL de água deionizada (DI) seguido de 20 μL de NaOH 1 M (catálise básica).CUIDADO: É importante adicionar a água DI primeiro. Ajustar o tubo de vidro de 5 mL, conforme explicado nas etapas 2.5-2.6, e sonicar por mais 1 h. Retire o tubo de vidro de 5 mL do banho ultrassônico. Coloque um ímã ao lado do tubo de vidro por 5 min para coletar os NWs. Substitua o sobrenadante por 1 mL de etanol absoluto fresco e sonicate por 10 s. Repita as etapas 2.10-2.11 quatro vezes. Transfira todos os NWs de etanol suspenso para um novo tubo de vidro de 5 mL usando uma pipeta de 1 mL.NOTA: Os NWs revestidos com APTES podem ser armazenados em um tubo de vidro com etanol até que sejam necessários. O protocolo pode ser pausado aqui. 3. Biofuncionalização dos nanofios Ativando os anticorposNOTA: Para atingir aproximadamente 3 x 104 partes de anticorpo/NW, use 30 μL de anticorpo (1 mg/mL) por 0,1 mg de ferro.Em um tubo de 2 mL, dissolver 0,4 mg de 3-3-dimetil-aminopropilcarbodiimida (EDC) e 1,1 mg de sulfo-N-hidroxisulfosuccinimida (Sulfo-NHS) em 1 mL de hidrato de ácido etanossulfônico 2-N-morfolino (MES) (pH 4,7).NOTA: A mistura EDC/sulfo-NHS deve ser fresca e preparada antes de usar. Em um novo tubo de 2 mL, adicionar 30 μL de anticorpo anti-CD44 (1 mg/mL), 960 μL de 0,1 M de solução salina tamponada com fosfato (PBS, pH 7) e 10 μL da mistura EDC/sulfo-NHS (preparada na etapa 3.1.1), respectivamente. Colocar o tubo de 2 ml num agitador de tubo a 10 x g durante 15 minutos à temperatura ambiente. Preparação dos nanofios revestidos com APTESDurante os 15 min de incubação na etapa 3.1.3, lave os NWs colocando um ímã ao lado do tubo de NWs revestido com APTES (da etapa 2.13) por 2 min para coletar os NWs. Descarte o etanol e substitua-o por 1 mL de PBS 0,1 M (pH 7) e, em seguida, sonicate por 10 s. Repita a etapa 3.2.1-3.2.2 quatro vezes. Colete os NWs, conforme explicado na etapa 3.2.1, e descarte o PBS de 0,1 M. Mantenha os NWs no tubo sem qualquer solução. Fixação dos anticorposTransferir toda a solução de anticorpos activados (preparada na etapa 3.1.3) para o tubo NWs (preparado no ponto 3.2.4) e sonicar durante 10 s. Coloque o tubo de vidro no rotador durante a noite a 4 °C. Recolher os NWs usando um ímã como na etapa 3.2.1 e descartar o sobrenadante. Adicionar 1 mL de solução de albumina de soro bovino (BSA) a 2% por 1 h a 4 °C para bloquear a reação. Verificar a antigenicidade dos NWs funcionalizados com anticorpos, por exemplo, usando ensaios de imunoprecipitação (IP) e western blot (WB).NOTA: Para obter melhores resultados, use os NWs biofuncionalizados no ensaio de IP, WB ou biocompatibilidade imediatamente após a etapa de bloqueio. 4. Ensaio de biocompatibilidade NOTA: Para estudar a biocompatibilidade dos NWs, vários ensaios de viabilidade celular e diferentes linhagens celulares podem ser empregados. A concentração dos NWs aqui utilizados é baseada em publicação anterior16. A semeadura celular deve ser feita um dia antes da biofuncionalização do NW. ATENÇÃO: Todas as etapas abaixo devem ser feitas sob o gabinete de biossegurança. Em uma placa de 96 poços, semeie nove poços com 4 x 104 de células de câncer de cólon (linhagem celular HCT116) suspensas em meio de cultura celular de McCoy (100 μL/poço) e coloque-as dentro da incubadora durante a noite a 37 °C e 5% de dióxido de carbono (CO2). Lavar os NWs (do passo 3.3.4) com PBS, recolhendo-os com um íman como no passo 3.2.1 e substituir a solução antiga por 1 ml de PBS 0,01 M (pH 7). Repita esta etapa três vezes. Lave os NWs (da etapa 4.2) com a mídia de McCoy aquecida, coletando-os usando um ímã como na etapa 3.2.1 e substitua a PBS antiga por 1 mL de mídia de McCoy aquecida. Repita esta etapa três vezes. Coletar os NWs (da etapa 4.3) usando um ímã como na etapa 3.2.1 e substituir o 1 mL de meio de McCoy aquecido por 900 μL de meio de McCoy aquecido. A concentração de NWs deve ser de 0,02 mg de NWs por mL. Leve a placa de 96 poços (do passo 4.1) da incubadora para o gabinete de biossegurança. Sob o gabinete de biossegurança, elimine o meio antigo das células e substitua-o por 100 μL de NWs suspensos (preparados na etapa 4.4). Agitar manualmente a placa (preparada no passo 4.6) e, em seguida, incubá-la durante 24 h no interior da incubadora a 37 °C e 5% de CO2. No dia seguinte, retire a placa de 96 poços (preparada na etapa 4.7) da incubadora. Sob o gabinete de biossegurança, adicionar 11 μL do reagente de viabilidade celular (Tabela de Materiais) a cada poço usando a pipeta multiparede. Agite o prato com o agitador de pratos a uma velocidade de 10 x g por 10 s. Incubar a placa por 1 h na incubadora. Retire a placa de 96 poços (preparada na etapa 4.10) da incubadora. Leia a placa no leitor de microplacas (Tabela de Materiais) medindo a absorbância do reagente de viabilidade celular (excitação 540 nm, emissão 590 nm).

Representative Results

É importante cortar os discos de alumínio (Al) (Figura 2A) em pequenos pedaços (Figura 2B) para encaixar no tubo utilizado. Depois de adicionar 1 M de NaOH às peças de Al, uma reação deve começar imediatamente, o que é observado pela criação de bolhas. Se nenhuma reação ocorrer em 1 min ou se a reação for muito rápida e a solução ficar completamente turva com uma nuvem branca, remova a solução antiga de NaOH imediatamente e substitua-a por uma solução nova. Verifique o valor de pH da solução de NaOH. Deve ser pH>12. Quando os NWs forem liberados das peças de Al nos primeiros 30 min com NaOH, os NWs (clusters pretos, Figura 3A) estarão flutuando dentro da solução de NaOH. Na última etapa de liberação dos NWs, a solução deve ser homogênea. Nenhum cluster de NWs deve estar presente (Figura 3B). Se os NWs foram coletados com um ímã por 3 min, a solução deveria estar clara e a pelota NW deveria ser preta (Figura 3C). Se o pellet estiver cinza, descarte o tubo e comece novamente com uma nova amostra de Al. Durante o processo de liberação, os NWs obtêm uma camada de óxido de ferro nativo com cerca de 5 nm de espessura, semelhante a relatos anteriores11,16,20. Esta camada de óxido tem importante contribuição para a biocompatibilidade 16, funcionalização16,18 e propriedades magnéticas20 dos NWs. No entanto, manter os NWs em seu modelo (ou seja, não liberá-los) até que seja necessário evitará que eles tenham efeitos ambientais sobre eles. O diâmetro e o comprimento médios dos NWs após o processo de liberação foram de 2,5 μm e 41,5 nm, respectivamente. A massa de um único NW pode ser calculada como explicado na Tabela 1 e confirmada por espectroscopia de massa com plasma indutivamente acoplado (ICP-MS). Aqui, cada disco de alumina continha cerca de 0,3 mg de ferro. Para reduzir a agregação dos NWs após a liberação e permitir uma maior funcionalização, os NWs foram revestidos com APTES. Este revestimento fornece grupos amina livres e tem a capacidade de revestir materiais magnéticos e não magnéticos39,45, tornando-o adequado para o revestimento de NWs multi-segmentados, como NWs de ferro/ouro. Durante o revestimento dos nanofios, é importante focar em duas coisas. Primeiro, calcule o volume necessário das moléculas APTES62 com base na área de superfície e na massa dos NWs. Esses cálculos foram apresentados na Tabela 2. Em segundo lugar, mantenha os nanofios em um movimento contínuo para evitar sua aglomeração e o bloqueio de algumas partes das superfícies NW do revestimento APTES. Por exemplo, neste protocolo, os nanofios foram incubados sob o banho ultrassônico e rotador durante o revestimento APTES e funcionalização do anticorpo, respectivamente. Cada molécula APTES contém um átomo de silício e um grupo amina funcional terminal21. Portanto, mapas de espectroscopia de perda de energia eletrônica (EELS) podem ser usados para confirmar a presença do revestimento APTES mostrando átomos de silício (cor rosa) na superfície NW (Figura 4A). Em contraste, os NWs não revestidos mostram os átomos de ferro em azul casca (Figura 4B) e os átomos de mistura ferro/oxigênio em azul claro (Figura 4B). O mapeamento EELS correspondente de NWs não revestidos (Figura 4C,4D) mostra uma maior intensidade de ferro versus oxigênio no centro (Figura 4C) do que na superfície (Figura 4D), indicando uma estrutura ferro-óxido (núcleo-casca). No mapeamento EELS (Figura 4 C,4D) identificou-se que a camada de óxido de ferro nos NWs é Fe 3 O4 mais Fe do que Fe2O3, o que é semelhante a uma publicação anterior20. A antigenicidade dos anticorpos aderidos pode ser confirmada usando os ensaios IP e WB, onde uma banda pode ser observada na amostra positiva, mas não nos controles negativos (Figura 5). Note que para observar uma banda clara, não use menos de 0,1 mg de NWs/10 x 106 células. O ensaio de BCA (Tabela de Materiais) em combinação com alguns cálculos apresentados na Tabela 3 foi usado para quantificar o número de anticorpos no NW. Além disso, a medida do potencial zeta foi utilizada para elucidar a funcionalização da superfície. O grupo amina terminal no APTES reduziu a carga negativa dos NWs não recobertos, como mostrado na Figura 6. Os NWs funcionalizados com anticorpos também alteraram a carga em comparação com os NWs revestidos com APTES (Figura 6). Todas as medidas de potencial zeta foram realizadas em pH 7. O direcionamento celular específico dos NWs funcionalizados com anticorpos pode ser confirmado por microscopia confocal (Figura 7). A biocompatibilidade de qualquer novo nanomaterial deve ser testada antes de iniciar qualquer aplicação. Portanto, o ensaio de viabilidade celular foi utilizado e confirmou que os NWs não recobertos, revestidos com APTES e anticorpos, eram biocompatíveis mesmo com alta concentração (Figura 8). Figura 1: Esquemática representa o método de revestimento e biofuncionalização dos nanofios. (A) Revestimento de NWs de ferro com APTES. (B) Ativação dos anticorpos usando EDC + Sulfo-NHS, para ter no final (C) um nanofio funcionalizado de anticorpos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 2: Disco de alumínio depositado em ferro. (A) O disco de alumínio antes do corte. (B) As linhas vermelhas mostravam onde cortar o disco. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 3: Etapas de liberação do nanofio. (A) Aglomerados de nanofios estão flutuando em solução de NaOH. A imagem foi obtida 10 min após a adição do NaOH e após a remoção da membrana de Al. (B) Nanofios suspensos em etanol. A foto foi tirada na última etapa de liberação, imediatamente após a etapa de sonicação. (C) Granulação de nanofio preto coletada por um ímã. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 4: Mapa de espectroscopia de perda de energia eletrônica (EELS). (A) Nanofio revestido com APTES (APTES-NW). As cores azul e rosa representam átomos de ferro e silício, respectivamente. (B) Nanofio não revestido (NW). As cores azul da casca e azul claro representam o mapeamento da mistura ferro e ferro/oxigênio, respectivamente. O mapeamento EELS correspondente de (C) o núcleo e (D) a casca dos NWs não revestidos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 5: Confirmação da funcionalização e atividade dos nanofios conjugados com anticorpos. A antigenicidade dos NW-CD44 foi confirmada por imunoprecipitação (IP) e western blot (WB). +Ve: representa o controle positivo (lisado celular completo). -Ve: representa o controle negativo (somente NW não revestido). – Células CD44: representam células que não expressam antígeno CD44; + Células CD44: representam células cancerosas do cólon que expressam o antígeno CD44. Esta é uma mancha representativa de n = 3 experimentos independentes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 6: Valores de potencial Zeta para NWs, APTES-NWs e anticorpos. As barras representam a média ± o erro padrão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 7: Imagens microscópicas confocais mostram o direcionamento específico. CD44-NWs são mostrados aderindo (A e C), enquanto os Isotype-NWs (controle negativo) não se fixaram (B e D). As cores vermelha, azul e verde representam a membrana celular, o núcleo e o aglomerado de CD44-NWs, respectivamente. A e B são as imagens de campo brilhante de C e D, respectivamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 8: Estudo da viabilidade celular de células de câncer de cólon (HCT116) incubadas com diferentes formulações de nanofios. As células foram tratadas com NWs após 24h de incubação e, em seguida, incubadas por 24h com NWs. Todos os experimentos foram realizados dentro de uma estufa a 37 °C. As barras representam a média ± o erro padrão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Parâmetro Valor Unidade Comprimento de Fe NW (h) 2.6 μm Raio (diâmetro/2) (r) 0.01679231 μm Densidade de Fe (D) 7.87 g/cm3 1 Fe NW volume (V)= π r^2h 2,30E-15 centímetro3 1 Fe NW massa = V x D 1,80E-08 μg 1 Fe NW área de superfície = 2π r^2 + 2πrh 2,76E-01 μm2 2,8E+05 nm2 Tabela 1: Cálculo da massa NW do ferro. Parâmetro Valor Unidade Densidade de APTES/100 μL* 9,50E-01 g Peso do molécular (MW) de APTES 2,21E+02 g/mol Número de APTES mol = massa/MW 4.29E-03 Mol Número de moléculas APTES/100 μL** 2,57E+21 Moléculas Tamanho APTES *** 5.00E-01 Nm Área de superfície APTES 2.00E-01 nm2 Área de superfície NW**** 2,76E+05 nm2 Número de NWs em 0,3mg de NW **** 1,70E+10 Nws Número de moléculas APTES necessárias para criar uma camada ao redor do NW 1,38E+06 Molécula APTES Número de moléculas APTES necessárias para 0,3 mg de NWs 2,35E+16 Molécula APTES *Refrence número 61 ** Número de moléculas = Número de mol*avogadro (6E+23) Refrence número 62 Da Tabela 1 Tabela 2: Cálculo do número de moléculas APTES necessárias para o revestimento de NWs.   Anticorpo IgG em forma de Y NW Massa para um anticorpo 2,3E-13 μg 1,8E-08 μg* Área de superfície para um anticorpo 23 NM2 2,6E+05 nm2 Baseado no ensaio BCA 0,3 mg por 1 mg O número da molécula de anticorpo e NW em 0,3 mg de anticorpo por mg de NW ~1E+15 anticorpos ** por ~5.6E+10 NWs Número de moléculas de anticorpos por NW ~2E+04 anticorpos por 1 NW*** *Calculado a partir da tabela 1 **O número de anticorpos em 0,3 mg foi calculado dividindo-se o número de anticorpos que recebemos do ensaio de BSA (0,3 mg) pelo peso molecular médio dos anticorpos IgG em forma de Y (180 kDa = 3E-16 mg). Com base na área de superfície de uma molécula de anticorpos IgG em forma de Y (~23 nm2) e na área de superfície de um NW (~2,6E+05 nm2), cerca de 1E+04 anticorpos seriam suficientes para criar uma monocamada no NW. No nosso caso, a densidade de anticorpos foi duas vezes maior do que a esperada. Isso pode estar relacionado ao revestimento APTES que fornece mais braços que permite a alta fixação dos anticorpos. Este caso garante que o NW está totalmente coberto com os anticorpos e a oportunidade para o anticorpo se ligar a um antígeno de superfície celular, independentemente da orientação dos NWs será alta. No entanto, se a densidade de anticorpos for menor do que o número esperado (molécula de anticorpo 1E+04), a chance de ligação entre a célula e os NWs será menor. Tabela 3: Cálculo do número de anticorpos no nanofio.

Discussion

Como acontece com qualquer método de fabricação e revestimento de nanomateriais, é necessária uma alta qualidade das soluções utilizadas. As soluções de liberação (NaOH 1M) e funcionalização (MES) podem ser reutilizadas várias vezes. No entanto, verificar seu valor de pH antes de iniciar um novo processo é muito importante. Na etapa de liberação, a lavagem dos NWs com NaOH deve ser realizada pelo menos quatro vezes. Quanto melhor a lavagem, melhor a estabilidade dos NWs e menos agregados. A camada de óxido aumenta a estabilidade dos NWs após imersão em etanol ou água63.

O diâmetro e o comprimento dos NWs foram afetados após o revestimento com APTES e anticorpos. Aqui, o diâmetro aumentou de 41,5 nm para 70 nm, e o comprimento diminuiu de 2,5 μm para 1,6 μm, devido às etapas de sonicação que quebram os NWs. Portanto, é essencial caracterizar a morfologia dos NWs após a etapa de biofuncionalização.

A ligação dos anticorpos aos NWs depende da interação covalente entre o grupo amina (no APTES) e o grupo carboxila (no anticorpo). Portanto, a confirmação da presença do revestimento APTES é uma etapa importante, para a qual utilizamos o mapeamento EELS. O método de revestimento é seguro e direto. Não necessita de altas temperaturas ou longos tempos de incubação. Além disso, o revestimento APTES funciona como um ligante para permitir a ligação covalente de outros anticorpos ou proteínas que tem um grupo carboxila.

No caso da biofuncionalização dos NWs com um anticorpo, a antigenicidade dos sítios de ligação dos anticorpos após o processo de biofuncionalização pode ser afetada. O método IP e WB pode ser usado para investigar esse problema. A utilização do método de biofuncionalização mencionado neste protocolo permitirá que os anticorpos se liguem aos NWs com alta antigenicidade a um receptor celular específico. Além disso, a biofuncionalização dos NWs com anticorpos adicionou a capacidade de atingir as células com o receptor de interesse, CD44 aqui. Isso foi confirmado por microscopia confocal. Embora a biocompatibilidade dos NWs não recobertos tenha sido alta (>95%), a adição de APTES ou anticorpos aos NWs aumentou sua biocompatibilidade em 100%.

Além disso, o protocolo de revestimento e biofuncionalização é eficiente, econômico e reprodutível. Deve ser aplicável a qualquer outro nanomaterial de óxido de ferro-ferro, pelo que a concentração do revestimento e dos anticorpos ligados deve ser otimizada com base na área de superfície e na massa do nanomaterial. Este protocolo pode ser feito com segurança em condições ambientais no laboratório geral. A biofuncionalização aumentou significativamente a biocompatibilidade do nanomaterial e sua capacidade de direcionamento. Em geral, os NWs são materiais extremamente promissores para aplicações nanomédicas (incluindo tratamentos multimodais ou combinatórios, detecção ou orientação celular e sensoriamento biológico). Combinado com a biofuncionalização, como descrito aqui, o direcionamento celular específico pode ser alcançado para maior precisão e eficácia.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

A pesquisa relatada nesta publicação foi apoiada pela Universidade de Ciência e Tecnologia Rei Abdullah (KAUST).

Materials

2 mL tube (snap-cap Microcentrifuge) Eppendorf, Fisherscientific 05-402-7
2-N-Morpholino EthaneSulfonic acid hydrate 99% (MES) Thermscientific AC172590250 Concentration 0.1 M and pH 4.7
3-3-Dimethyl-aminopropyl Carbodiimide (EDC) Thermofisher PG82079
3-AminoPropyl-Tri-Ethoxy-Silane (APTES) Sigma Aldrich 919302
5 mL glass tube Fisherscientific 03-339-22C
96-well plate ( flat bottom) Sigma Aldrich CLS3595
Anti-CD44 antibody BD Biosciences 550990 Clone 515, concentration 1 mg/mL
APTES ((3-Aminopropyl)triethoxysilane), 99% Sigma Aldrich 919-30-2 Concentration 99%
BCA assay (Pierce BCA Protein Assay Kit) Thermofisher 23225
Bovine Serum Albumin solution (BSA) Sigma Aldrich 9048-46-8 Concentration 35%
Cell incubator Thermofisher 50116047
Cell viability reagent AlamarBlue,Thermofisher DAL1025
Colon cancer cells – HCT116 cell line ATCC 430641
Hardwood Hammer Any hammer tool can be used, there is no specific brand.
Inductively coupled plasma Mass Spectrometer (ICP-MS) Perkin Elmer ELAN 9000 ICP-MS The used software is "Elan instrument control session"
Laboratory Retort Stand with Clamp RVFM 13-0140 This is used to handle the 5 mL glass tube in the sonicator bath.
Magnetic rack (DynaMag-2 Magnet) Thermofisher 12321D
McCoy’s 5A Medium 1x Gibco 16600082
Microplate reader (Bio-Rad xMark Absorbance Spectrophotometer) Bio-Rad 1681150 Microplate Manager 6 software (#168-9520)
Phosphate buffered saline (PBS) 10x Gibco 14200067 Concentration 0.1 M (No calcuim, no magnesium)
Phosphate buffered saline (PBS) 1x Gibco 14190136 Concentration 0.01 M (No calcuim, no magnesium)
Plate shaker (Microplate Genie) Scientific Industries (Genie) SI-0400
Single Edge Razor blades Polysciences 08410-1
Sodum hydrixide (NaOH) Sigma Aldrich 1310-73-2 Concentration 1 M, pH 13
Sulfo-N-HydroxySulfosuccinimide (sulfo-NHS) Thermofisher 106627-54-7
Trypsin ATCC 30-2101
Tube rotator VWR 10136-084
Tube shaker (Eppendorf Thermomixer R Mixer, 2.0 mL) Eppendorf, Fisherscientific 05-400-204
Ultrasonic bath (2510) Branson 2489502
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Alsharif, N. A., Merzaban, J. S., Kosel, J. Biofunctionalization of Magnetic Nanomaterials. J. Vis. Exp. (161), e61360, doi:10.3791/61360 (2020).
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