JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Nederlands

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioengineering

Biofunctionalisering van magnetische nanomaterialen

Published: July 16, 2020
doi:
10.3791/61360
, ,
1Division of Biological and Environmental Sciences and Engineering,King Abdullah University of Science and Technology, 2Division of Computer, Electrical and Mathematical Sciences and Engineering,King Abdullah University of Science and Technology

Summary

In dit werk bieden we een protocol om magnetische nanomaterialen te biofunctionaliseren met antilichamen voor specifieke celtargeting. We gebruiken bijvoorbeeld ijzeren nanodraden om kankercellen aan te pakken.

Abstract

Magnetische nanomaterialen hebben veel aandacht gekregen in verschillende biomedische toepassingen. Het biofunctionaliseren van deze nanomaterialen met specifieke doelgerichte middelen is een cruciaal aspect om hun werkzaamheid in diagnostiek en behandelingen te verbeteren en tegelijkertijd de bijwerkingen te minimaliseren. Het voordeel van magnetische nanomaterialen ten opzichte van niet-magnetische nanomaterialen is hun vermogen om contactloos en over grote afstanden te reageren op magnetische velden. Dit maakt het mogelijk om ze te begeleiden of te accumuleren, terwijl ze ook kunnen worden gemonitord. Onlangs zijn magnetische nanodraden (NW’s) met unieke eigenschappen ontwikkeld voor biomedische toepassingen. Het grote magnetische moment van deze NW’s maakt een efficiëntere afstandsbediening van hun beweging mogelijk door middel van een magnetisch veld. Dit is met groot succes gebruikt bij de behandeling van kanker, medicijnafgifte, celtracering, stamceldifferentiatie of magnetische resonantiebeeldvorming. Bovendien biedt de NW-fabricage door middel van sjabloonondersteunde elektrochemische afzetting een veelzijdige methode met strakke controle over de NW-eigenschappen. Vooral ijzer-NW’s en ijzer-ijzeroxide (kern-schaal) NW’s zijn geschikt voor biomedische toepassingen, vanwege hun hoge magnetisatie en lage toxiciteit.

In dit werk bieden we een methode om ijzer/ijzeroxide NW’s te biofunctionaliseren met specifieke antilichamen gericht tegen een specifieke celoppervlaktemarker die tot overexpressie wordt gebracht in een groot aantal kankercellen. Omdat de methode gebruik maakt van de eigenschappen van het ijzeroxideoppervlak, is het ook van toepassing op superparamagnetische ijzeroxide-nanodeeltjes. De NW’s worden eerst gecoat met 3-aminopropyl-tri-ethoxy-silaan (APTES) dat als een linker fungeert, waaraan de antilichamen covalent worden gehecht. De APTES-coating en de biofunctionalisering van antilichamen worden bewezen door elektronenenergieverliesspectroscopie (EELS) en zeta-potentiaalmetingen. Daarnaast wordt de antigeniciteit van de antilichamen op de NW’s getest door gebruik te maken van immunoprecipitatie en western blot. De specifieke targeting van de gebiofunctionaliseerde NW’s en hun biocompatibiliteit worden bestudeerd door confocale microscopie en een cellevensvatbaarheidstest.

Introduction

Een unieke eigenschap van magnetische nanomaterialen is hun vermogen om te reageren op magnetische velden1, die nuttig kunnen worden gebruikt om ze op vele manieren te activeren, terwijl ze ook kunnen worden gecontroleerd, bijvoorbeeld door magnetische resonantiebeeldvorming (MRI). Bij het toepassen van een wisselend magnetisch veld met hoge frequentie kunnen ze warmte genereren, wat hyperthermie kan veroorzaken, wat een therapeutische optie1 biedt. Een andere benadering is fotothermische behandeling, die kan worden gerealiseerd met een nabij-infrarood (NIR) laser 2,3.

Van het grote aantal magnetische nanomaterialen heeft ijzeroxide de meeste aandacht gekregen in biologische toepassingen zoals magnetische scheiding, hyperthermie2,4, celgeleiding5, medicijnafgifte 6,7,8 en als contrastmiddel in MRI 9,10. Dit komt door hun hoge biocompatibiliteit 11,12, grote magnetisatie 11,12, het vermogen om te worden gecoat 9,13,14,15, het vermogen om medicijnen te dragen 2,16, het vermogen om te worden gefunctionaliseerd met medicijnen2,16 en/of het targeten van middelen 12,13,17,18, en het vermogen om optische energie om te zetten in warmte2. Onlangs is MagForce begonnen met klinische onderzoeken bij kankerpatiënten die ijzeroxide-nanodeeltjes gebruiken voor de behandeling van hyperthermie19.

De laatste tijd worden magnetische nanodraden (NW’s) steeds meer gebruikt voor biomedische toepassingen 3,11,16,20,21,22. Ze hebben vergelijkbare eigenschappen als magnetische nanobolletjes, maar bieden een anisotrope vorm en een zeer groot magnetisch moment, waardoor een zeer efficiënte afstandsbediening door een magnetisch veld23,24 mogelijk is, inclusief laagfrequente bediening om magnetomechanische effecten te induceren 25,26,27,28,29. Als gevolg hiervan zijn de NW’s geïmplementeerd voor verschillende biologische toepassingen, zoals exosomenisolatie30 celtracking21, kankerbehandeling 3,11,16, medicijnafgifte16,31,32 en als MRI-contrastmiddel 33.

Biogefunctionaliseerde magnetische nanomaterialen met een specifiek vermogen om cellen te targeten hebben een groot potentieel voor biomedische toepassingen en in precisiegeneeskunde34,35. Om deze targetingmiddelen te bevestigen, is een oppervlaktemodificatie op de nanomaterialen nodig. Meestal hebben ze een coating nodig die zorgt voor een functionele groep, wat de hechting van de behandelaars vergemakkelijkt. In de literatuur is er een groot aantal organische en anorganische coatings voor magnetische nanomaterialen. Op basis van de functionele groep die kan worden geïmmobiliseerd tot het nanomateriaal, kunnen deze coatings worden onderverdeeld in vier hoofdgroepen: moleculen op basis van carbonzuurgroepen, polymeren, histidine en moleculen op basis van silaangroepen.

De moleculen op basis van carbonzuurgroepen is een van de oppervlaktemodificatiemethoden. Het maakt gebruik van de hoge affiniteit
tussen de negatieve carbonzuurgroep op de coating en de positieve lading op de magnetische nanomaterialen36,37,38. Het bindingsproces van een carbonzuur aan een metaaloppervlak kan gepaard gaan met het genereren van metaalcarboxylaatzouten of de hechting van de carboxylgroep aan het metaal. Voor NW’s met meerdere segmenten, zoals ijzer/goud of nikkel/goud NW’s, die uitstekende eigenschappen hebben voor bio-toepassingen39,40, kan dit type coating echter niet gemakkelijk worden aangebracht. Er zijn twee verschillende coatings tegelijk nodig: thiolgroepen voor het modificeren van de goudsegmenten en carboxylgroepen voor magnetische segmenten (ijzer of nikkel)38. Enkele voorbeelden van moleculen op basis van carboxylgroepen zijn hematoporfyrine, pimelzuur, palmitinezuur en 3-[(2-aminoethyl)dithio] propionzuur (AEDP)38. Oppervlaktemodificaties van magnetische nanomaterialen met behulp van polymeren bieden een aantal duidelijke voordelen. Door het grote molecuulgewicht van de polymeren verbetert het de stabiliteit van het magnetische nanomateriaal in een oplossing38. Het zal echter de grootte van het nanomateriaal aanzienlijk vergroten38. Polyvinylpyrrolidon (PVP), polyethyleenimine (PEI), arginine-glycine-D-asparaginezuur (RGD) en polyethyleenglycol (PEG) zijn enkele voorbeelden van de meest gebruikte polymeren voor oppervlaktemodificaties. Elk heeft zijn eigen kenmerken en maakt gebruikvan 38. De derde methode voor oppervlaktemodificatie is het gebruik van een histidinecoating. Histidine is een eiwit met een zijketen van histidine-aminozuren dat een hoge affiniteit heeft met een beperkt aantal magnetische nanomaterialen zoals nikkel38. Het kan worden gebruikt voor eiwitzuiveringsprocessen 38,41,42. Een histidinecoating kan ook worden aangebracht op NW’s met meerdere segmenten, zoals nikkel/goud NW’s38. De silanisatie van een nanomateriaaloppervlak is een goed ingeburgerd proces 38,43,44. Het is gebaseerd op een siliciumatoom dat via drie enkelvoudige bindingen aan elk metaaloxideoppervlak is gekoppeld, en tegelijkertijd bindt dit siliciumatoom aan het einde aan de functionele groep via eenalkylketen 38,43,44. Het voordeel van deze coating is dat er vrije aminegroepen zijn en dat het de mogelijkheid heeft om zowel magnetische als niet-magnetische materialen te coaten38,45, zoals respectievelijk nikkel en goud. Daarom is het gebruik van moleculen op basis van de zoute groep een praktische route voor het biofunctionaliseren van multi-gesegmenteerde NW’s. Enkele voorbeelden van moleculen op basis van silaangroepen zijn (3-aminopropyl) triethoxysilaan (APTES) en (3-aminopropyl) trimethoxysilaan (APTMS)38,45.

De toevoeging van een targetingmiddel aan de coating kan een belangrijke rol spelen bij zowel de diagnose als de behandeling van zieke cellen en tegelijkertijd de bijwerkingen op gezonde weefsels minimaliseren46,47. De toevoeging van een targetingmiddel op het oppervlak van nanomaterialen verbetert zowel cellulaire selectieve binding als internalisatie via endocytosereceptoren7. Zonder deze gerichte liganden interageren nanomaterialen niet-specifiek met celmembranen, die met een lagere snelheid binden in vergelijking met de nanomaterialen met de liganden48. Een van de uitdagingen bij het aanpakken van kankerweefsels is hun karakteristieke gelijkenis met gezonde weefsels. Daarom hangt het succes van targeting voornamelijk af van het bepalen van het juiste ligand om als biologisch doelwit te gebruiken49,50. Er zijn verschillende targetingmiddelen gebruikt om nanomaterialen naar kankercellen te leiden48,51 (bijv. CD44, vanwege de hoge expressie in kankercellen in vergelijking met gezonde cellen52,53,54,55).

Targeting-agenten kunnen worden onderverdeeld in drie hoofdgroepen, op basis van de componenten waaruit ze zijn gemaakt en hun complexiteit: op aptameren gebaseerde targeting, op liganden gebaseerde targeting en op antilichamen gebaseerde targeting. Aptameren zijn korte chemisch gesynthetiseerde strengen DNA of RNA-oligonucleotiden die zijn gevouwen in twee- en driedimensionale structuren, waardoor ze zich kunnen richten op een specifiek antigeen,meestal eiwitten. Ligand-gebaseerde targeting omvat peptiden en korte aminozuurketens57. Op antilichamen gebaseerde targeting omvat het gebruik van een heel antilichaam of antilichaamfragmenten, zoals variabele fragmenten met één keten of antigeenbindende fragmenten51. Het gebruik van deze methode heeft het voordeel dat het twee bindingsplaatsen bezit met een hoge bindingsaffiniteit voor het specifieke doelantigeen, waardoor het een buitengewoon hoge selectiviteit heeft58. De bindingsplaatsen zijn analoog aan een slot en het antigeen aan een sleutel58.

In dit werk werden de gebruikte NW’s vervaardigd door elektrodepositie op aluminiumoxidemembranen, een methode die in detail werd beschreven in een eerdere publicatie59. De focus ligt hier op het vrijmaken van deze ijzer-ijzeroxide (kern-schaal) NW’s uit de membranen en het biofunctionaliseren ervan met specifieke antilichamen om een targetingvermogen te bieden. De antilichamen kunnen zich niet direct binden aan de ijzer-ijzeroxide NW’s en hebben een linker nodig. Het coaten van de NW’s met APTES levert vrije aminegroepen op, waardoor de covalente hechting via de carboxylgroep op de antilichamen mogelijk wordt (Figuur 1). Het voordeel van de APTES-coating is dat hij kan werken voor zowel magnetische21 als niet-magnetische60 materialen, zoals ijzer/goud of nikkel/goud NW’s45. Alle coating- en biofunctionalisatiestappen die in dit protocol worden uitgelegd, kunnen in het algemeen worden gebruikt met elk ijzer/ijzeroxide-nanomateriaal. IJzer/ijzeroxide NW’s werden hier als voorbeeld gebruikt. De resultaten tonen aan dat de antilichaam-gefunctionaliseerde NW’s een hoge antigeniciteit hebben tegen specifieke receptoren op het celoppervlak, die voor verschillende toepassingen kunnen worden gebruikt. Voorbeelden hiervan zijn celscheiding, medicijnafgifte, specifieke kankercelbehandeling met behulp van fotothermische en/of magnetomechanische behandelingen.

Protocol

LET OP: Raadpleeg voor gebruik altijd alle relevante veiligheidsinformatiebladen (MSDS). Gebruik alle geschikte veiligheidspraktijken en persoonlijke beschermingsmiddelen (veiligheidsbril, handschoenen, laboratoriumjas, lange broek, schoenen met gesloten neus). Voer alle biologische reacties uit in de biologische zuurkast. OPMERKING: Dit protocol is bedoeld om 2 x 10 10 gebiofunctionaliseerde NW’s/ml te produceren die overeenkomen met 0.36 mg ijzer/ml gecoat met anti-CD44-antilichamen met een dichtheid van 3 x10 4 antilichamen/NW. De ijzer-ijzeroxide (kern-schaal) NW’s zijn 2,5 μm lang en hebben een diameter van 41,5 nm. 1. Vrijkomen van ijzeren nanodraden OPMERKING: Het fabricageproces van de NW’s van ijzer/ijzeroxide is in een eerdere publicatie uitvoerig toegelicht59. Snijd op een snijmat de aluminium (Al) schijven (Figuur 2A) in kleine stukjes (Figuur 2B) met behulp van een mes met één rand en een kleine hamer om in een buis van 2 ml te passen. Gebruik een pincet om de kleine Al-stukjes over te brengen naar de buis. Vul het buisje van 2 ml, met daarin de kleine stukjes Al, met 1 ml natriumhydroxide van 1 M (NaOH). Zorg ervoor dat alle Al-stukken bedekt zijn met de NaOH. Laat de oplossing 30 minuten inwerken bij kamertemperatuur in een chemische zuurkast. Verwijder alleen de Al-stukken met behulp van het pincet en bewaar de vrijgekomen NW’s (zwarte clusters, figuur 3A) nog 30 minuten in de NaOH-oplossing. Verander de NaOH-oplossing niet. Verzamel de NW’s door de buis van 2 ml in een magnetisch rek te plaatsen en wacht 2 minuten voordat u de oude 1 M NaOH-oplossing verwijdert. Vervang het door verse NaOH-oplossing. Sonificeer de buis van 2 ml met de NW’s gedurende 30 s en laat deze gedurende 1 uur in een chemische zuurkast staan. Herhaal stap 1.5-1.6 minstens vier keer. Was de NW’s door de slang van 2 ml in het magnetische rek te plaatsen en wacht 2 minuten. Gooi de NaOH-oplossing weg en vervang deze door 1 ml absolute ethanol. Sonificeer de buis gedurende 30 s. Plaats de tube van 2 ml in het magnetische rek en wacht 2 minuten. Gooi de oude absolute ethanoloplossing weg en vervang deze door 1 ml verse absolute ethanol en sonicaat gedurende 30 s. Herhaal stap 1.11 en 1.12 minstens vier keer. Bewaar de NW’s in 1 ml absolute ethanol bij kamertemperatuur totdat ze nodig zijn. Meet de ijzerconcentratie en dus de NW’s met behulp van inductief gekoppelde plasmamassaspectrometrie (ICP-MS).OPMERKING: Het protocol kan hier worden gepauzeerd. Voor langdurige opslag moet u de NW’s echter pas vrijgeven uit de Al-sjabloon als ze nodig zijn. Door de vrijgekomen NW’s lange tijd in de ethanol te laten neerslaan zonder frequente sonicatie, ontstaan aggregaties die langere tijden van sonicatie nodig hebben om te worden gescheiden. 2. Coaten van de nanodraden met APTES OPMERKING: In dit protocol is 100 μL APTES-oplossing (dichtheid van 0,946 g/ml61) voldoende om 1,6 x 107 m2/g NW’s te coaten. Als er een verandering optreedt in de verhouding of de massa van het nanomateriaal, moet het APTES-volume dienovereenkomstig worden aangepast. Breng de NW’s van stap 1.14 over naar een glazen buisje van 5 ml met behulp van een pipet van 1 ml. Om eventuele NW’s die in de tube van 2 ml zijn achtergebleven op te vangen, wast u de lege tube van 2 ml twee keer door 1 ml absolute ethanol toe te voegen en deze met een pipet van 1 ml over te brengen naar de glazen tube van 5 ml. Neem met behulp van de pipet 100 μL APTES en voeg dit rechtstreeks toe aan de NW-oplossing. Draai de glazen buis van 5 ml gedurende 10 s. Stel de glazen buis van 5 ml af op de klem van een laboratoriumretortstandaard. Plaats de helft van de glazen buis van 5 ml in het water van het ultrasoonbad en sonificeer gedurende 1 uur. Haal de glazen buis van 5 ml uit het ultrasoonbad en voeg 400 μL gedeïoniseerd (DI) water toe, gevolgd door 20 μL 1 M NaOH (basiskatalyse).LET OP: Het is belangrijk om eerst het DI-water toe te voegen. Pas de glazen buis van 5 ml aan, zoals uitgelegd in stap 2.5-2.6, en sonificeer nog eens 1 uur. Haal de glazen buis van 5 ml uit het ultrasoonbad. Plaats een magneet gedurende 5 minuten naast de glazen buis om de NW’s op te vangen. Vervang het supernatans door 1 ml verse absolute ethanol en sonificeer gedurende 10 s. Herhaal stap 2.10-2.11 vier keer. Breng alle NW’s gesuspendeerde ethanol over in een nieuwe glazen buis van 5 ml met behulp van een pipet van 1 ml.OPMERKING: De APTES-gecoate NW’s kunnen worden bewaard in een glazen buis met ethanol totdat ze nodig zijn. Het protocol kan hier worden gepauzeerd. 3. Biofunctionalisatie van de nanodraden Activeren van de antilichamenOPMERKING: Om ongeveer 3 x 104 delen antilichaam/NW te bereiken, gebruikt u 30 μL antilichaam (1 mg/ml) per 0,1 mg ijzer.Los in een buisje van 2 ml 0,4 mg 3-3-dimethylaminopropylcarbodiimide (EDC) en 1,1 mg sulfo-N-hydroxysulfosuccinimide (Sulfo-NHS) op in 1 ml 2-N-morfolino-ethaansulfonzuurhydraat (MES) (pH 4,7).NOTITIE: Het EDC/sulfo-NHS-mengsel moet vers en bereid zijn voor gebruik. Voeg in een nieuw buisje van 2 ml respectievelijk 30 μl anti-CD44-antilichaam (1 mg/ml), 960 μl 0,1 M fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS, pH 7) en 10 μl EDC/sulfo-NHS-mengsel (bereid in stap 3.1.1) toe. Plaats de tube van 2 ml in een tube shaker van 10 x g gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Bereiding van de APTES gecoate nanodradenWas tijdens de incubatie van 15 minuten in stap 3.1.3 de NW’s door gedurende 2 minuten een magneet naast de APTES-gecoate NW-buis (uit stap 2.13) te plaatsen om de NW’s op te vangen. Gooi de ethanol weg en vervang deze door 1 ml 0.1 M PBS (pH 7) en sonificeer vervolgens gedurende 10 s. Herhaal stap 3.2.1-3.2.2 vier keer. Verzamel de NW’s, zoals uitgelegd in stap 3.2.1, en gooi de 0.1 M PBS weg. Bewaar de NW’s in de buis zonder enige oplossing. Aanhechting van de antilichamenBreng alle geactiveerde antilichaamoplossing (bereid in stap 3.1.3) over in de NWs-buis (bereid in 3.2.4) en sonificeer gedurende 10 s. Plaats de glazen buis een nacht in de rotator bij 4 °C. Verzamel de NW’s met behulp van een magneet zoals in stap 3.2.1 en gooi de supernatant weg. Toevoeging van 1 ml 2% runderserumalbumine (BSA)-oplossing gedurende 1 uur bij 4 °C om de reactie te blokkeren. Controleer de antigeniciteit van de gefunctionaliseerde NW’s van het antilichaam, bijvoorbeeld met behulp van immunoprecipitatie (IP) en western blot (WB) assays.OPMERKING: Gebruik voor betere resultaten de gebiofunctionaliseerde NW’s in de IP-, WB- of biocompatibiliteitstest onmiddellijk na de blokkeringsstap. 4. Biocompatibiliteitstest OPMERKING: Om de biocompatibiliteit van de NW’s te bestuderen, kunnen verschillende cellevensvatbaarheidstests en verschillende cellijnen worden gebruikt. De concentratie van de hier gebruikte NW’s is gebaseerd op een eerdere publicatie16. Het zaaien van cellen moet een dag voor de NW-biofunctionalisatie worden gedaan. LET OP: Alle onderstaande stappen moeten onder de bioveiligheidskast worden uitgevoerd. Zaai in een plaat met 96 putjes negen putjes met 4 x 104 darmkankercellen (HCT116-cellijn) gesuspendeerd in McCoy’s celkweekmedia (100 μL/putje) en plaats het een nacht in de incubator bij 37 °C en 5% kooldioxide (CO2). Was de NW’s (uit stap 3.3.4) met PBS door ze op te vangen met behulp van een magneet zoals in stap 3.2.1 en vervang de oude oplossing door 1 ml 0,01 M PBS (pH 7). Herhaal deze stap drie keer. Was de NW’s (uit stap 4.2) met opgewarmde McCoy’s media door ze op te vangen met behulp van een magneet zoals in stap 3.2.1 en vervang de oude PBS door 1 ml verwarmde McCoy’s media. Herhaal deze stap drie keer. Verzamel de NW’s (uit stap 4.3) met behulp van een magneet zoals in stap 3.2.1 en vervang de 1 ml opgewarmde McCoy’s media door 900 μL verwarmde McCoy’s media. De NW-concentratie moet 0,02 mg NW’s per ml zijn. Breng de plaat met 96 putjes (uit stap 4.1) van de incubator naar de bioveiligheidskast. Gooi onder de bioveiligheidskast de oude media uit de cellen en vervang deze door 100 μL gesuspendeerde NW’s (voorbereid in stap 4.4). Schud de plaat (bereid in stap 4.6) met de hand en incubeer deze vervolgens gedurende 24 uur in de incubator bij 37 °C en 5% CO2 . Haal de volgende dag de plaat met 96 putjes (voorbereid in stap 4.7) uit de couveuse. Voeg onder de bioveiligheidskast 11 μL van het cellevensvatbaarheidsreagens (materiaaltabel) toe aan elk putje met behulp van de meerwandige pipet. Schud de plaat met de platenschudder met een snelheid van 10 x g gedurende 10 s. Incubeer de plaat gedurende 1 uur in de broedstoofmachine. Haal de plaat met 96 putjes (voorbereid in stap 4.10) uit de couveuse. Lees de plaat af in de microplaatlezer (Tabel met materialen) door de absorptie van het reagens voor de levensvatbaarheid van de cel te meten (excitatie 540 nm, emissie 590 nm).

Representative Results

Het is belangrijk om de aluminium (Al) schijven (Figuur 2A) in kleine stukjes (Figuur 2B) te snijden om in de gebruikte buis te passen. Na het toevoegen van 1 M NaOH aan de Al-stukken, moet onmiddellijk een reactie beginnen, die wordt waargenomen door het creëren van bellen. Als er binnen 1 minuut geen reactie optreedt of als de reactie erg snel is en de oplossing volledig troebel wordt met een witte wolk, verwijder dan onmiddellijk de oude NaOH-oplossing en vervang deze door een nieuwe oplossing. Controleer de pH-waarde van de NaOH-oplossing. Het moet pH>12 zijn. Wanneer de NW’s in de eerste 30 minuten met NaOH uit de Al-stukken worden losgelaten, zullen de NW’s (zwarte clusters, Figuur 3A) in de NaOH-oplossing zweven. In de laatste stap van het vrijgeven van de NW’s moet de oplossing homogeen zijn. Er mag geen cluster van NW’s zijn (Figuur 3B). Als NW’s gedurende 3 minuten met een magneet werden verzameld, moet de oplossing helder zijn en moet de NW-pellet zwart zijn (Figuur 3C). Als de pellet grijs was, gooi dan de buis weg en begin opnieuw met een nieuw Al-monster. Tijdens het vrijgaveproces verkrijgen de NW’s een natuurlijke ijzeroxidelaag met een dikte van ongeveer 5 nm, wat vergelijkbaar is met eerdere rapporten11,16,20. Deze oxidelaag heeft een belangrijke bijdrage aan de biocompatibiliteit 16, functionalisatie16,18 en magnetische eigenschappen20 van de NW’s. Door de NW’s echter in hun sjabloon te houden (d.w.z. ze niet vrij te geven) totdat ze nodig zijn, worden ze niet beschermd tegen milieueffecten. De gemiddelde diameter en lengte van de NW’s na het vrijgaveproces waren respectievelijk 2,5 μm en 41,5 nm. De massa van een enkele NW kan worden berekend zoals uitgelegd in tabel 1 en wordt bevestigd door inductief gekoppelde plasmamassaspectroscopie (ICP-MS). Hier bevatte elke aluminiumoxideschijf ongeveer 0,3 mg ijzer. Om de aggregatie van de NW’s na het vrijgeven te verminderen en verdere functionalisering mogelijk te maken, werden de NW’s gecoat met APTES. Deze coating levert vrije aminegroepen en heeft de mogelijkheid om zowel magnetische als niet-magnetische materialen te coaten39,45, waardoor het geschikt is voor het coaten van NW’s met meerdere segmenten, zoals ijzer/gouden NW’s. Tijdens de coating van nanodraden is het belangrijk om op twee dingen te focussen. Bereken eerst het benodigde volume van APTES-moleculen62 op basis van het oppervlak en de massa van de NW’s. Deze berekeningen zijn weergegeven in tabel 2. Ten tweede, houd de nanodraden in een continue beweging om te voorkomen dat ze samenklonteren en dat sommige delen van NW-oppervlakken worden geblokkeerd door APTES-coating. In dit protocol werden de nanodraden bijvoorbeeld geïncubeerd onder het ultrasone bad en de rotator tijdens respectievelijk de APTES-coating en de functionalisering van antilichamen. Elk APTES-molecuul bevat een siliciumatoom en een terminale functionele aminegroep21. Daarom kunnen elektronenenergieverliesspectroscopie (EELS)-kaarten worden gebruikt om de aanwezigheid van de APTES-coating te bevestigen door siliciumatomen (roze kleur) op het NW-oppervlak weer te geven (Figuur 4A). De niet-gecoate NW’s tonen daarentegen de ijzeratomen in schorsblauw (Figuur 4B) en ijzer/zuurstofmengselatomen in lichtblauw (Figuur 4B). De overeenkomstige EELS-mapping van niet-gecoate NW’s (Figuur 4C,4D) toont een hogere intensiteit van ijzer versus zuurstof in het centrum (Figuur 4C) dan aan het oppervlak (Figuur 4D), wat wijst op een ijzer-ijzeroxide (kern-schaal) structuur. Uit de EELS-mapping (figuur 4 C,4D) bleek dat de ijzeroxidelaag op de NW’s Fe 3 O4 meer is dan Fe2O3, wat vergelijkbaar is met een eerdere publicatie20. De antigeniciteit van de aangehechte antilichamen kan worden bevestigd met behulp van de IP- en WB-assays, waarbij een band kan worden waargenomen op het positieve monster, maar niet op de negatieve controles (figuur 5). Merk op dat om een duidelijke band in acht te nemen, u niet minder dan 0,1 mg NW’s/10 x 106 cellen mag gebruiken. De BCA-test (Table of Materials) in combinatie met enkele berekeningen in tabel 3 werd gebruikt om het aantal antilichamen op de NW te kwantificeren. Verder werd de zeta-potentiaalmeting gebruikt om de oppervlaktefunctionalisatie op te helderen. De terminale aminegroep op APTES verminderde de negatieve lading van de niet-gecoate NW’s, zoals weergegeven in figuur 6. De met antilichamen gefunctionaliseerde NW’s veranderden ook de lading in vergelijking met de met APTES gecoate NW’s (Figuur 6). Alle zeta-potentiaalmetingen werden gedaan bij pH 7. De specifieke celtargeting van de antilichaam-gefunctionaliseerde NW’s kan worden bevestigd met behulp van confocale microscopie (Figuur 7). De biocompatibiliteit van elk nieuw nanomateriaal moet worden getest voordat met een toepassing wordt begonnen. Daarom werd de cellevensvatbaarheidstest gebruikt, die bevestigde dat de niet-gecoate, APTES-gecoate en antilichaam-gecoate NW’s biocompatibel waren, zelfs met een hoge concentratie (Figuur 8). Figuur 1: Schematisch geeft de coating- en biofunctionalisatiemethode van de nanodraden weer. (A) Strijkijzer NW’s coaten met APTES. (B) Het activeren van de antilichamen met behulp van EDC + Sulfo-NHS, om aan het einde (C) een antilichaam gefunctionaliseerde nanodraad te hebben. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 2: IJzeren afgezette aluminium schijf. (A) De aluminium schijf voor het snijden. (B) De rode lijnen gaven aan waar de schijf moest worden gesneden. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken. Figuur 3: Stappen voor het losmaken van nanodraad. (A) Clusters van nanodraden drijven in de NaOH-oplossing. De foto is gemaakt 10 minuten na het toevoegen van de NaOH en na het verwijderen van het Al-membraan. (B) Nanodraden gesuspendeerd in ethanol. De foto is genomen in de laatste loslaatstap, direct na de sonicatiestap. (C) Zwarte nanodraadkorrel verzameld door een magneet. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 4: Elektronen-energieverliesspectroscopie (EELS)-kaart. (A) APTES-gecoate nanodraad (APTES-NW). De blauwe en roze kleuren vertegenwoordigen respectievelijk ijzer- en siliciumatomen. (B) Niet-gecoate nanodraad (NW). De blauwe en lichtblauwe kleuren van de schors vertegenwoordigen respectievelijk de ijzer- en ijzer/zuurstofmixmapping. De bijbehorende EELS-mapping van (C) de kern en (D) de schil van de niet-gecoate NW’s. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 5: Bevestiging van functionalisatie en activiteit van antilichaam geconjugeerde nanodraden. De antigeniciteit van CD44-NW’s werd bevestigd door gebruik te maken van immunoprecipitatie (IP) en western blot (WB). +Ve: staat voor de positieve controle (volcellig lysaat). -Ve: vertegenwoordigt de negatieve controle (alleen niet-gecoate NW). – CD44-cellen: vertegenwoordigt cellen die geen CD44-antigeen tot expressie brengen; + CD44-cellen: vertegenwoordigt darmkankercellen die CD44-antigeen tot expressie brengen. Dit is een representatieve vlek van n = 3 onafhankelijke experimenten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 6: Zeta-potentiaalwaarden voor NW’s, APTES-NW’s en antilichamen. De balken vertegenwoordigen het gemiddelde ± standaardfout. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 7: Confocale microscopische beelden tonen de specifieke targeting. CD44-NW’s worden getoond als hechtende (A en C), terwijl de Isotype-NW’s (negatieve controle) niet hechten (B en D). De rode, blauwe en groene kleuren vertegenwoordigen respectievelijk het celmembraan, de kern en het cluster van CD44-NW’s. A en B zijn de heldere veldbeelden van respectievelijk C en D. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 8: Cellevensvatbaarheidsstudie van darmkankercellen (HCT116) geïncubeerd met verschillende formuleringen van nanodraden. De cellen werden na 24 uur incubatie behandeld met NW’s en vervolgens 24 uur geïncubeerd met de NW’s. Alle experimenten werden uitgevoerd in een incubator bij 37 °C. De balken vertegenwoordigen het gemiddelde ± standaardfout. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Parameter Waarde Eenheid Lengte van Fe NW (h) 2.6 μm Straal (diameter/2) (r) 0.01679231 μm Fe-dichtheid (D) 7.87 g/cm3 1 Fe NW volume (V)= π r^2h 2.30E-15 cm3 1 Fe NW massa = V x D 1.80E-08 μg 1 Fe NW oppervlakte = 2π r^2 + 2πrh 2.76E-01 μm2 2.8E+05 NM2 Tabel 1: Berekening van de NW-massa van het ijzer. Parameter Waarde Eenheid Dichtheid van APTES/100 μL* 9.50E-01 g Molecuulgewicht (MW) van APTES 2,21E+02 g/mol Aantal APTES-mol = massa/MW 4.29E-03 Mol Aantal APTES-moleculen/100 μL** 2.57E+21 Moleculen APTES maat *** 5.00E-01 Nm APTES oppervlakte 2.00E-01 NM2 NW oppervlakte**** 2,76E+05 NM2 Aantal NW’s in 0,3 mg NW **** 1.70E+10 Nws Aantal APTES-moleculen dat nodig is om één laag rond het NW te creëren 1,38E+06 APTES-molecuul Aantal APTES-moleculen dat nodig is voor 0,3 mg NW’s 2.35E+16 APTES-molecuul *Referentienummer 61 ** Aantal moleculen = Aantal mol*avogadro aantal (6E+23) Referentienummer 62 Uit tabel 1 Tabel 2: Bereken het aantal APTES-moleculen dat nodig is voor het coaten van NW’s.   Y-vormig IgG-antilichaam NW Massa voor één antilichaam 2,3E-13 μg 1,8E-08 μg* Oppervlakte voor één antilichaam 23 NM2 2.6E+05 nm2 Gebaseerd op BCA-test 0,3 mg per 1 mg Het getal van het antilichaammolecuul en NW in 0,3 mg antilichaam per mg NW ~1E+15 antilichamen ** per ~5.6E+10 NWs Aantal antilichaammoleculen per NW ~2E+04 antilichamen per 1 NW*** *Berekend op basis van tabel 1 **Het aantal antilichamen in 0,3 mg werd berekend door het aantal antilichamen dat we ontvingen van de BSA-test (0,3 mg) te delen door het gemiddelde molecuulgewicht van Y-vormige IgG-antilichamen (180 kDa = 3E-16 mg). Op basis van het oppervlak van één molecuul Y-vormige IgG-antilichamen (~23 nm2) en het oppervlak van één NW (~2.6E+05 nm2), zouden ongeveer 1E+04 antilichamen voldoende zijn om een monolaag op het NW te creëren. In ons geval was de dichtheid van antilichamen twee keer meer dan de verwachte hoeveelheid. Dit kan te maken hebben met de APTES-coating die zorgt voor meer armen die de hoge hechting van de antilichamen mogelijk maken. Dit geval zorgt ervoor dat de NW volledig bedekt is met de antilichamen en dat de kans voor het antilichaam om te binden aan een antigeen op het celoppervlak, ongeacht de oriëntatie van de NW’s, hoog zal zijn. Als de dichtheid van de antilichamen echter lager is dan het verwachte aantal (1E+04 molecuul antilichaam), dan zal de bindingskans tussen de cel en de NW’s lager zijn. Tabel 3: Berekening van het aantal antilichamen op de nanodraad.

Discussion

Zoals bij elke fabricage- en coatingmethode van nanomaterialen, is een hoge kwaliteit van de gebruikte oplossingen vereist. De release (1 M NaOH) en functionalisatie (MES) oplossingen kunnen meerdere keren worden hergebruikt. Het is echter erg belangrijk om de pH-waarde te controleren voordat een nieuw proces wordt gestart. In de vrijgavestap moeten de NW’s met NaOH ten minste vier keer worden gewassen. Hoe beter de wassing, hoe beter de stabiliteit van de NW’s en hoe minder ze aggregaat zijn. De oxidelaag verbetert de stabiliteit van de NW’s bij onderdompeling in ethanol of water63.

De diameter en de lengte van de NW’s werden aangetast nadat ze waren bedekt met APTES en antilichamen. Hier nam de diameter toe van 41,5 nm naar 70 nm en de lengte van 2,5 μm naar 1,6 μm, als gevolg van de sonicatiestappen die de NW’s breken. Daarom is het essentieel karakteriseer de morfologie van de NW’s na de biofunctionalisatiestap.

De aanhechting van de antilichamen aan de NW’s berust op de covalente interactie tussen de aminegroep (op APTES) en de carboxylgroep (op het antilichaam). Daarom is het bevestigen van de aanwezigheid van de APTES-coating een belangrijke stap, waarvoor we EELS-mapping hebben gebruikt. De coatingmethode is veilig en eenvoudig. Het heeft geen hoge temperaturen of lange incubatietijden nodig. APTES-coating werkt ook als een linker om de covalente hechting van andere antilichamen of eiwitten met een carboxylgroep mogelijk te maken.

In het geval van biofunctionalisering van de NW’s met een antilichaam, kan de antigeniciteit van de bindingsplaatsen van de antilichamen na het biofunctionalisatieproces worden beïnvloed. De IP- en WB-methode kunnen worden gebruikt om dit probleem te onderzoeken. Door gebruik te maken van de biofunctionalisatiemethode die in dit protocol wordt genoemd, kunnen de antilichamen zich binden aan de NW’s met een hoge antigeniciteit aan een specifieke celreceptor. Bovendien voegde het biofunctionaliseren van de NW’s met antilichamen het vermogen toe om zich te richten op de cellen met de receptor van belang, CD44 hier. Dit werd bevestigd door confocale microscopie. Hoewel de biocompatibiliteit van de niet-gecoate NW’s hoog was (>95%), verbeterde het toevoegen van APTES-coating of antilichamen aan de NW’s hun biocompatibiliteit met 100%.

Verder is het coating- en biofunctionaliseringsprotocol efficiënt, economisch en reproduceerbaar. Het moet van toepassing zijn op elk ander ijzer-ijzeroxide-nanomateriaal, waarbij de concentratie van zowel de coating als de aangehechte antilichamen moet worden geoptimaliseerd op basis van het oppervlak en de massa van het nanomateriaal. Dit protocol kan veilig worden uitgevoerd bij omgevingscondities in het algemene laboratorium. De biofunctionalisering heeft de biocompatibiliteit van het nanomateriaal en hun targetingvermogen aanzienlijk verbeterd. Over het algemeen zijn de NW’s zeer veelbelovende materialen voor nanomedische toepassingen (waaronder multimodale of combinatorische behandelingen, celdetectie of -geleiding, en biologische detectie). In combinatie met biofunctionalisatie, zoals hier beschreven, kan specifieke celtargeting worden bereikt voor meer precisie en werkzaamheid.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Onderzoek dat in deze publicatie wordt gerapporteerd, werd ondersteund door de King Abdullah University of Science and Technology (KAUST).

Materials

2 mL tube (snap-cap Microcentrifuge) Eppendorf, Fisherscientific 05-402-7
2-N-Morpholino EthaneSulfonic acid hydrate 99% (MES) Thermscientific AC172590250 Concentration 0.1 M and pH 4.7
3-3-Dimethyl-aminopropyl Carbodiimide (EDC) Thermofisher PG82079
3-AminoPropyl-Tri-Ethoxy-Silane (APTES) Sigma Aldrich 919302
5 mL glass tube Fisherscientific 03-339-22C
96-well plate ( flat bottom) Sigma Aldrich CLS3595
Anti-CD44 antibody BD Biosciences 550990 Clone 515, concentration 1 mg/mL
APTES ((3-Aminopropyl)triethoxysilane), 99% Sigma Aldrich 919-30-2 Concentration 99%
BCA assay (Pierce BCA Protein Assay Kit) Thermofisher 23225
Bovine Serum Albumin solution (BSA) Sigma Aldrich 9048-46-8 Concentration 35%
Cell incubator Thermofisher 50116047
Cell viability reagent AlamarBlue,Thermofisher DAL1025
Colon cancer cells – HCT116 cell line ATCC 430641
Hardwood Hammer Any hammer tool can be used, there is no specific brand.
Inductively coupled plasma Mass Spectrometer (ICP-MS) Perkin Elmer ELAN 9000 ICP-MS The used software is "Elan instrument control session"
Laboratory Retort Stand with Clamp RVFM 13-0140 This is used to handle the 5 mL glass tube in the sonicator bath.
Magnetic rack (DynaMag-2 Magnet) Thermofisher 12321D
McCoy’s 5A Medium 1x Gibco 16600082
Microplate reader (Bio-Rad xMark Absorbance Spectrophotometer) Bio-Rad 1681150 Microplate Manager 6 software (#168-9520)
Phosphate buffered saline (PBS) 10x Gibco 14200067 Concentration 0.1 M (No calcuim, no magnesium)
Phosphate buffered saline (PBS) 1x Gibco 14190136 Concentration 0.01 M (No calcuim, no magnesium)
Plate shaker (Microplate Genie) Scientific Industries (Genie) SI-0400
Single Edge Razor blades Polysciences 08410-1
Sodum hydrixide (NaOH) Sigma Aldrich 1310-73-2 Concentration 1 M, pH 13
Sulfo-N-HydroxySulfosuccinimide (sulfo-NHS) Thermofisher 106627-54-7
Trypsin ATCC 30-2101
Tube rotator VWR 10136-084
Tube shaker (Eppendorf Thermomixer R Mixer, 2.0 mL) Eppendorf, Fisherscientific 05-400-204
Ultrasonic bath (2510) Branson 2489502
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dürr, S. Magnetic nanoparticles for cancer therapy. Nanotechnology Reviews. 2 (4), 395-409 (2013).
  2. Espinosa, A. Duality of iron oxide nanoparticles in cancer therapy: amplification of heating efficiency by magnetic hyperthermia and photothermal bimodal treatment. ACS Nano. 10 (2), 2436-2446 (2016).
  3. Martínez Banderas, A. I., et al. Iron-Based Core-Shell Nanowires for Combinatorial Drug Delivery, Photothermal and Magnetic Therapy. ACS Applied Materials Interfaces. , (2019).
  4. Das, R. Tunable high aspect ratio iron oxide nanorods for enhanced hyperthermia. The Journal of Physical Chemistry. 120 (18), 10086-10093 (2016).
  5. Chen, J., et al. Guidance of stem cells to a target destination in vivo by magnetic nanoparticles in a magnetic field. ACS Applied Materials Interfaces. 5 (13), 5976-5985 (2013).
  6. Juneja, R., Roy, I. Iron oxide-doped niosomes as drug carriers for magnetically targeted drug delivery. International Journal of Nanomedicine. 13, 7 (2018).
  7. Aires, A., et al. Multifunctionalized iron oxide nanoparticles for selective drug delivery to CD44-positive cancer cells. Nanotechnology. 27 (6), 065103 (2016).
  8. Trabulo, S., Aires, A., Aicher, A., Heeschen, C., Cortajarena, A. L. Multifunctionalized iron oxide nanoparticles for selective targeting of pancreatic cancer cells. Biochimica et Biophysica Acta -General Subjects. 1861 (6), 1597-1605 (2017).
  9. Blanco-Andujar, C., et al. Design of iron oxide-based nanoparticles for MRI and magnetic hyperthermia. Nanomedicine. 11 (14), 1889-1910 (2016).
  10. Hachani, R., et al. Polyol synthesis, functionalisation, and biocompatibility studies of superparamagnetic iron oxide nanoparticles as potential MRI contrast agents. Nanoscale. 8 (6), 3278-3287 (2016).
  11. Contreras, M. F., Sougrat, R., Zaher, A., Ravasi, T., Kosel, J. Non-chemotoxic induction of cancer cell death using magnetic nanowires. International Journal of Nanomedicine. 10, 2141 (2015).
  12. Perez, J. E., et al. . Cytotoxicity. , (2018).
  13. Kievit, F. M., Zhang, M. Surface engineering of iron oxide nanoparticles for targeted cancer therapy. Accounts of Chemical Research. 44 (10), 853-862 (2011).
  14. Xu, H. Antibody conjugated magnetic iron oxide nanoparticles for cancer cell separation in fresh whole blood. Journal of Biomaterials. 32 (36), 9758-9765 (2011).
  15. Zhang, L., Dong, W. F., Sun, H. B. Multifunctional superparamagnetic iron oxide nanoparticles: design, synthesis and biomedical photonic applications. Nanoscale. 5 (17), 7664-7684 (2013).
  16. Martínez-Banderas, A. I., et al. Functionalized magnetic nanowires for chemical and magneto-mechanical induction of cancer cell death. Scientific Reports. 6, 35786 (2016).
  17. Tian, Q., et al. Multifunctional Polypyrrole@ Fe3O4 Nanoparticles for Dual-Modal Imaging and In Vivo Photothermal Cancer Therapy. Small. 10 (6), 1063-1068 (2014).
  18. Alsharif, N. A., Martiìnez-Banderas, A. I., Merzaban, J., Ravasi, T., Kosel, J. Biofunctionalizing Magnetic Nanowires Toward Targeting and Killing Leukemia Cancer Cells. IEEE Transactions on Magnetics. 2 (99), 1-5 (2018).
  19. Ventola, C. L. Progress in nanomedicine: approved and investigational nanodrugs. Journal of Pharmacy Therapeutics. 42 (12), 742 (2017).
  20. Ivanov, Y. P., et al. Tunable magnetic nanowires for biomedical and harsh environment applications. Scientific Reports. 6, 24189 (2016).
  21. Margineanu, M. B., et al. Semi-automated quantification of living cells with internalized nanostructures. Journal of Nanobiotechnology. 14 (1), 4 (2016).
  22. Jeon, Y. S., et al. Metallic Fe-Au Barcode Nanowires as a Simultaneous T Cell Capturing and Cytokine Sensing Platform for Immunoassay at the Single-Cell Level. ACS Applied Materials Interfaces. 11 (27), 23901-23908 (2019).
  23. Lee, E., et al. Highly selective CD44-specific gold nanorods for photothermal ablation of tumorigenic subpopulations generated in MCF7 mammospheres. Nanotechnology. 23 (46), 465101 (2012).
  24. Patel, N. S., Lago-Cachón, D., Mohammed, H., Moreno, J. A., Kosel, J. J. J. Iron Nanowire Fabrication by Nano-Porous Anodized Aluminum and its Characterization. Journal of Visualized Experiments. (152), e60111 (2019).
  25. Rozhkova, E. A., et al. Ferromagnetic microdisks as carriers for biomedical applications. Journal of Applied Physics. 105 (7), 306 (2009).
  26. Kim, D. H., et al. Biofunctionalized magnetic-vortex microdiscs for targeted cancer-cell destruction. Nature Materials. 9 (2), 165-171 (2010).
  27. Kim, D. H., et al. Mechanoresponsive system based on sub-micron chitosan-functionalized ferromagnetic disks. Journal of Materials Chemistry. 21 (23), 8422-8426 (2011).
  28. Vitol, E. A., Novosad, V., Rozhkova, E. A. Multifunctional ferromagnetic disks for modulating cell function. IEEE Transactions on Magnetics. 48 (11), 3269-3274 (2012).
  29. Vitol, E. A., Novosad, V., Rozhkova, E. A. Microfabricated magnetic structures for future medicine: from sensors to cell actuators. Nanomedicine. 7 (10), 1611-1624 (2012).
  30. Lim, J., et al. Direct isolation and characterization of circulating exosomes from biological samples using magnetic nanowires. Journal of Nanobiotechnology. 17 (1), 1-12 (2019).
  31. Shore, D., et al. Electrodeposited Fe and Fe–Au nanowires as MRI contrast agents. Chemical Communications. 52 (85), 12634-12637 (2016).
  32. Martínez-Banderas, A. I., et al. Iron-Based Core-Shell Nanowires for Combinatorial Drug Delivery and Photothermal and Magnetic Therapy. ACS Applied Materials Interfaces. 11 (47), 43976-43988 (2019).
  33. Martínez-Banderas, A. I., et al. Magnetic core-shell nanowires as MRI contrast agents for cell tracking. Journal of Nanobiotechnology. 18 (1), 1-12 (2020).
  34. Zhu, L., Zhou, Z., Mao, H., Yang, L. Magnetic nanoparticles for precision oncology: theranostic magnetic iron oxide nanoparticles for image-guided and targeted cancer therapy. Nanomedicine. 12 (1), 73-87 (2017).
  35. Guleria, A., Priyatharchini, K., Kumar, D. . Applications of Nanomaterials. , 345-389 (2018).
  36. Allara, D. L., Nuzzo, R. G. Spontaneously organized molecular assemblies. 2. Quantitative infrared spectroscopic determination of equilibrium structures of solution-adsorbed n-alkanoic acids on an oxidized aluminum surface. Langmuir. 1 (1), 52-66 (1985).
  37. Allara, D. L., Nuzzo, R. G. Spontaneously organized molecular assemblies. 1. Formation, dynamics, and physical properties of n-alkanoic acids adsorbed from solution on an oxidized aluminum surface. Langmuir. 1 (1), 45-52 (1985).
  38. Schrittwieser, S., Reichinger, D., Schotter, J. Applications, surface modification and functionalization of nickel nanorods. Materials and Structures. 11 (1), 45 (2018).
  39. Lim, J., Choi, M., Lee, H., Kim, Y. H., Han, J. Y., Lee, E. S., Cho, Y. Direct isolation and characterization of circulating exosomes from biological samples using magnetic nanowires. Journal of Nanobiotechnology. 17 (1), 1 (2019).
  40. Nemati, Z., et al. Magnetic Isolation of Cancer-derived Exosomes Using Fe/Au Magnetic Nanowires. ACS Applied Nano Materials. 3 (2), 2058-2069 (2020).
  41. Hainfeld, J. F., Liu, W., Halsey, C. M., Freimuth, P., Powell, R. D. Ni-NTA-gold clusters target His-tagged proteins. Journal of Structural Biology. 127 (2), 185-198 (1999).
  42. Agarwal, G., Naik, R. R., Stone, M. O. Immobilization of histidine-tagged proteins on nickel by electrochemical dip pen nanolithography. Journal of the American Chemical Society. 125 (24), 7408-7412 (2003).
  43. Aswal, D., Lenfant, S., Guerin, D., Yakhmi, J., Vuillaume, D. Self assembled monolayers on silicon for molecular electronics. Analytica Chimica Acta. 568 (1-2), 84-108 (2006).
  44. Haensch, C., Hoeppener, S., Schubert, U. S. Chemical modification of self-assembled silane based monolayers by surface reactions. Chemical Society Reviews. 39 (6), 2323-2334 (2010).
  45. Wildt, B., Mali, P., Searson, P. C. Electrochemical template synthesis of multisegment nanowires: Fabrication and protein functionalization. Langmuir. 22 (25), 10528-10534 (2006).
  46. Schladt, T. D., Schneider, K., Schild, H., Tremel, W. Synthesis and bio-functionalization of magnetic nanoparticles for medical diagnosis and treatment. Dalton Transactions. 40 (24), 6315-6343 (2011).
  47. Kumar, C. S. . Magnetic nanomaterials. , (2009).
  48. Peiris, P., et al. Precise targeting of cancer metastasis using multi-ligand nanoparticles incorporating four different ligands. Nanoscale. 10 (15), 6861-6871 (2018).
  49. Veiseh, O., Gunn, J. W., Zhang, M. Design and fabrication of magnetic nanoparticles for targeted drug delivery and imaging. Journal of Advanced Drug Delivery Reviews. 62 (3), 284-304 (2010).
  50. Rosenblum, D., Joshi, N., Tao, W., Karp, J. M., Peer, D. Progress and challenges towards targeted delivery of cancer therapeutics. Nature Communications. 9 (1), 1410 (2018).
  51. Bazak, R., Houri, M., El Achy, S., Kamel, S., Refaat, T. Cancer active targeting by nanoparticles: a comprehensive review of literature. Journal of Cancer Research Clinical Oncology. 141 (5), 769-784 (2015).
  52. Zeilstra, J., et al. CD44 expression in intestinal epithelium and colorectal cancer is independent of p53 status. PLoS One. 8 (8), 72849 (2013).
  53. Pesarrodona, M., et al. Intracellular targeting of CD44+ cells with self-assembling, protein only nanoparticles. International Journal of Pharmaceutics. 473 (1-2), 286-295 (2014).
  54. Chandra, V., et al. Quantitative assessment of CD44 genetic variants and cancer susceptibility in Asians: a meta-analysis. Oncotarget. 7 (45), 74286 (2016).
  55. Thapa, R., Wilson, G. D. The importance of CD44 as a stem cell biomarker and therapeutic target in cancer. Stem Cells International. 2016, (2016).
  56. Gao, S., Zheng, X., Jiao, B., Wang, L. Post-SELEX optimization of aptamers. Analytical Bioanalytical Chemistry. 408 (17), 4567-4573 (2016).
  57. Das, M., Mohanty, C., Sahoo, S. K. Ligand-based targeted therapy for cancer tissue. Expert Opinion on Drug Delivery. 6 (3), 285-304 (2009).
  58. Janeway, C. A., Travers, P., Walport, M., Shlomchik, M. . Immunobiology: the Immune System in Health and Disease. 2, (2001).
  59. Patel, N. S., Lago-Cachón, D., Mohammed, H., Moreno, J. A., Kosel, J. Iron Nanowire Fabrication by Nano-Porous Anodized Aluminum and its Characterization. Journal of Visualized Experiments. (152), e60111 (2019).
  60. Rao, X., et al. High density gold nanoparticles immobilized on surface via plasma deposited APTES film for decomposing organic compounds in microchannels. Applied Surface Science. 439, 272-281 (2018).
  61. . Merck. (3-Aminopropyl)triethoxysilane Available from: https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/440140?lang=en&region=SA (2020)
  62. Munguía-Cortés, L., et al. APTES-functionalization of SBA-15 using ethanol or toluene: Textural characterization and sorption performance of carbon dioxide. Journal of the Mexican Chemical Soceity. 61 (4), 273-281 (2017).
  63. Sperling, R. A., Parak, W. J. Surface modification, functionalization and bioconjugation of colloidal inorganic nanoparticles. Philosophical Transactions of the Royal Society A: Mathematical & Physical Engineering Sciences. 368 (1915), 1333-1383 (2010).

Tags

BiofunctionalizationMagnetic NanomaterialsIron-iron Oxide NanomaterialsMulti-segmented NanomaterialsIron-gold NanowiresCovalent BondAntibodiesAluminum DiscsSodium HydroxideNanowiresEthanolAPTESSonicationEDCSulfo-NHSMESAnti-CD44 AntibodyPBS

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Alsharif, N. A., Merzaban, J. S., Kosel, J. Biofunctionalization of Magnetic Nanomaterials. J. Vis. Exp. (161), e61360, doi:10.3791/61360 (2020).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image