単核食細胞の多パラメータフローサイトメトリック解析のためのマウス全体の眼の消化

自然免疫系には、補体の活性化および炎症を刺激する複数の細胞タイプが含まれる。自然免疫細胞には、ナチュラルキラー(NK)細胞、肥満細胞、好塩基球、好酸球、好中球、および単核食細胞が含まれる。単球、マクロファージ、樹状細胞からなる単核食細胞は、ブドウ膜炎、糖尿病性網膜症、加齢黄斑変性症(AMD)1を含む複数の眼科病態の病態生理に関与している。このプロトコルでは、新血管^AMD2のマウスモデルにおける多パラメータフローサイトメトリック解析を用いた単核食細胞の同定に焦点を当てる。このプロトコルは、糖尿病性網膜症および/またはuveitisのマウスモデルに適応可能であるが、これらの疾患の全身的な性質のために、より広範な眼解剖が推奨される。

単核食細胞は、重なり合う細胞表面マーカーを発現する。長期にわたる組織居住マクロファージおよびミクログリアは、黄身嚢由来のエリスロメロイド前駆体³に由来し、一方、マクロファージおよび樹状細胞を骨髄由来のマクロファージ樹状細胞前駆細胞⁴から分化した。単球に共通するマウス細胞表面マーカーは、マクロファージ、および樹状細胞、CD45、CD11b5、F4/806、Cx3cr1^7、および細胞内マーカーIba1 8を含^む。この課題を克服するために、複数の組織からマクロファージ、単球、および樹状細胞のトランスクリプトーム解析は、CD64をマクロファージ特異的細胞表面マーカー⁶と定義する。マクロファージは、虹彩、脈絡膜、毛様体、及び健康眼における視神経³に記載されている。あるいは、樹状細胞の識別がより困難である。樹状細胞同定の最も具体的な方法は、Zbtb46-GFPレポーターマウス⁹を使用して運命マッピングを必要とします。このレポーターラインとは無関係に、CD64の存在と併せてCD11cおよびMHCIIの発現は、潜在的な樹状細胞^6,10を同定することができる。樹状細胞は正常眼¹¹において角膜、結膜、虹彩、および脈絡膜で同定されている。ミクログリアは、そのレチナに位置する特殊なマクロファージであり、血液-腎障害によって保護され、黄身嚢前駆細胞¹²に由来する。その結果、レチナルミクログリアは、CD45発現¹³のそれらの薄暗いレベルと高レベルのTmem119によって単球由来マクロファージと区別することができ、これはフローサイトメトリー抗体¹⁴として利用可能である。しかし、ミクログリアの活性化時には、CD45はアップレギュレーション15、Tmem119はダウンレギュレート3となり、ミクログリア生物学の複雑さを示し、AMDとそのマウスモデルの両方に関連する可能性があります。最後に、単球は、古典と非古典的を含む少なくとも2つのサブタイプに分けることができます。古典的な単球ディスプレイCCR2^{+Ly6C高CX3CR1低}発現、および非古典的単球はCCR2-Ly6C^{低CX3CR1ハイ}マーカー⁵を実証する。

マーカー発現の定量的分析、すなわち、高いレベルと低/薄暗いレベルの必要性により、多パラメータフローサイトメトリーは、眼および他の組織における単球、マクロファージ、ミクログリア、樹状細胞間の識別に理想的な方法である。その他の利点としては、サブ集団の同定、蛍光活性化細胞分類(FACS)を使用して、転写またはプロテオミクス解析のために細胞集団を分類する能力、および運命マッピングが含まれる。マルチパラメータフローサイトメトリーの主な欠点は、組織アーキテクチャの欠如です。これは、角膜、結膜、虹彩、レンズ、失膜、および脈絡膜-スクレラ複合体:様々な眼部区画への眼圧解剖によって克服することができる。さらに、確認免疫蛍光イメージングを行うことができますが、マーカーの数と堅牢な定量の欠如によって制限されます。

ゲノムワイド関連研究は、複数の補体遺伝子をAMD¹⁶と結合している。補体活性化はアナフィラトキシン産生、白血球のリクルート、および結果として生じる炎症をもたらす。補体受容体欠損マウスにおいて、レーザー傷害は、単核食細胞の動員およびレーザー誘導脈絡膜新血管化(CNV)領域¹⁷を減少させる。同様に、C-Cモチーフケモカイン受容体2(CCR2)ノックアウトマウスは、組織への単球募集に欠損しており、単核食細胞のリクルートとレーザー誘導CNV領域¹⁸の両方を示す。これらのデータは、実験的CNVおよびおそらく新血管AMDを有する単核食細胞を補完する。この関連を支持して、補体受容体は、新血管AMD^19,20の患者において末梢血単球に対して調節不全である。これらのデータは、AMDと単核食細胞との間の強い関連を示す。

本稿では、実験レーザー誘導CNVモデルを用いて、マルチパラメータフローサイトメトリーを用いてマウスアイ中の単核食細胞集団を特徴付ける。レーザー誘導CNVは、新血管AMDの標準的なマウスモデルであり、現在の第1線新幹線AMD療法²¹の有効性を実証した。このプロトコルは、マウスの目の核形成、眼解剖、単一細胞懸濁液への消化、抗体染色、単色制御を用いたレーザー電圧の決定、および蛍光マイナス1(FMO)制御を用いた測定戦略について説明する。レーザー誘発CNVモデルの詳細な説明については、前の出版物²²を参照してください。このプロトコルを用いて、ミクログリア、単球、樹状細胞、マクロファージ集団を定義する。さらに、MHCIIとCD11cを用いて、レーザー誘導CNVモデル内のマクロファージサブセットをさらに定義します。