複数の中枢神経系領域からのマウスグリアの解剖と分離

注:すべての動物実験は、クリーブランドクリニックラーナー研究所の施設動物管理および使用委員会によって承認および承認されました。 1.解剖用の培地と消耗品を準備します メモ: すべてのバッファおよびメディアレシピを 表 1 に示します。この手順は、組織培養で指定されたバイオセーフティキャビネット内で無菌条件下で行われます。 混合グリア培地(MGM)を調製し、滅菌濾過する。これは前日に行い、4°Cで保存することができます。 フィブロネクチンを滅菌H2Oで1:100の濃度で希釈する。希釈されたフィブロネクチンの量は、実験に使用された子犬の数とCNS領域によって異なります。1つの皮質に1つのT25フラスコ、2〜4小脳に1つのT25フラスコ、2〜4の脳幹に1つのT25フラスコ、2〜4の脊髄に1つのT25フラスコを使用します。注:上記の基準を使用して同じ領域の組織を組み合わせると、以下に説明するプロトコルを変更することなく、適切な解離が可能になります。ステップ1.2に記載したよりも多くの組織を組み合わせるには、解離試薬濃度のさらなる最適化が必要になります。 希釈したフィブロネクチン3 mLを室温でT25フラスコにピペットで入れ、2分間放置します。 フィブロネクチンを吸引し、フラスコの蓋を緩めた状態でフラスコを一晩乾燥させます。 2.皮質、小脳、脳幹、脊髄解離 注:この手順はベンチトップで行うことができ、解剖スコープが必要です。手順のすべてのステップに厳格な無菌技術を使用し、室内の空気への組織の暴露を最小限に抑えます。解剖中はすべての培地を氷上で冷やして、組織を最大限に保存してください。あるいは、この手順は、内部解剖スコープの使用を可能にするフード内で行うことができます。 70%エタノールですべての領域を拭きます。 10 mLのPBS/抗生物質溶液(PAS)を10 cmのペトリ皿にピペットで入れます。解剖する子犬ごとに1つのペトリ皿を準備します。溶液を冷やしておくために氷の上に置きます。 消毒した組織培養フードで、9 mLのDMEM(添加物なし)を4本の別々の15 mLコニカルチューブ(CNS領域ごとに1本ずつ)にピペットし、チューブキャップを交換し、氷上に置きます。解剖スコープから届く距離内にチューブ付きのアイスバケツを置きます。 ステップ2.2で調製した10cmのシャーレを消毒した解剖スコープステージに置く。 施設のプロトコルに従ってマウスの子犬を麻酔して安楽死させ、鋭いハサミで迅速に斬首して頭を取り除きます。注:出生後(P)3〜5匹の子犬が使用されます。年配の子犬はより発達したCNSを持っており、グリア細胞を拡大する適切な供給源ではない可能性があります。若い子犬(P)0-2は、より多くのグリアを産出する可能性があり、使用することができます。しかし、脊髄組織は、サイズのためにこの若い年齢で解剖することは非常に困難です。 70%エタノールを使用して子犬の皮膚をきれいにします。 細かいハサミを使用して、鼻に達するまで、尾側から始めて吻側を動かしながら、動物の頭の正中線に沿って皮膚層を切ります。組織の損傷を避けるために、頭蓋骨に深く切り込むことは避けてください。 頭を下に傾け、皮膚層を頭蓋骨の両側に引き、スプリングハサミを使用して、頭蓋骨の正中線に沿って、大孔から始めて切開し、再び尾側から吻側に切断します。 先端の細かい鉗子で、頭蓋骨の半分を左右に引っ張り、皮質、小脳、脳幹を露出させます。 露出したら、脳を頭蓋骨からそっと持ち上げ、ステップ2.2で準備した10cmのペトリ皿に入れます。解剖学的構造を維持するために、後脳を取り付けた状態で、脳が損傷を受けていないことを確認してください。 鉗子の先端を上に向けて、先端が湾曲した細かい鉗子を使用して、小脳をつまみます。髄膜を取り除き、アイスバケット内の指定された15mLコニカルチューブに入れます。 脳幹が小脳の直接腹側にあり、小脳の除去後に見えることを確認してください。先端の細かい鉗子でそれを取り除き、髄膜を取り除き、アイスバケット内の指定された15mLのコニカルチューブに入れます。 中脳を皮質から分離し、皮質髄膜を取り除き、アイスバケット内の指定された15mLの円錐管に入れます。 脊髄を取り外すには、切断されたマウスの子犬を仰臥位(上向きに横たわっている)に置き、切断された脊柱を研究者に向かって持ち上げます。 70%エタノールを再度スプレーします。 脊柱の外側に沿って、吻側から尾方向に、後肢に達するまで胸郭を通して切断します。切断しながら、脊柱が見えるまで内臓を押し戻します。 脊柱の各側面に沿って分離されるまで切断し、ステップ2.2で準備した10cmのペトリ皿に入れます。 腹側を上にして、細かいスプリングハサミを使用して、各椎骨の右側と左側を腰部に到達するまで交互に切断し、脊髄組織を露出させます。 解剖顕微鏡の下で、先端の細かい鉗子で脊髄と髄膜をそっと取り除きます。アイスバケット内の指定された15mLコニカルチューブに入れます。 子犬ごとに手順2.5.〜2.19を繰り返し、同じ領域の組織を組み合わせて、準備されたT25フラスコごとに手順1.2で概説した基準に適合させます。注意: 髄膜をできるだけ完全に取り除きます。かなりの量の髄膜が残っている場合、髄膜細胞の線維芽細胞様表現型が増殖し、細胞培養を圧倒します。特定の細胞培養物を生成するために、等しい表現型の複数の脊髄を組み合わせることができる。グリアポトーシスや表現型の差別化につながる可能性のある細胞の過密が起こらないように注意してください。 3.組織解離 注:以下の手順はすべて、無菌技術と滅菌材料を使用して、滅菌組織培養で指定されたバイオセーフティキャビネットで実行されます。 0.53 mM EDTAを含む0.05%トリプシンを1 mL 9 mL DMEMおよび組織の各15 mLコニカルチューブに追加して、組織溶解を開始します。注:DMEMには、トリプシンの阻害剤として機能する可能性のある塩化カルシウムが大量に含まれています。概説された手順に従って解離が完了しない場合は、カルシウムまたはマグネシウムを含まないハンクスバランス塩溶液を使用できます。トリプシン処理後、トリプシン阻害剤を添加することで酵素を中和できますが、カルシウムは後続のステップで使用されるDNase Iの補因子であるため、溶液に戻す必要があります。 10 mLピペットで約20倍に粉砕します。 細胞懸濁液を空の50 mLコニカルチューブに移します。 この溶液を37°C、5%CO2 で15分間インキュベートし、8分後にライセートを穏やかに撹拌する。 5 mLのMGMと200 μL(5 mg/mL)のDNase Iを各チューブに加え、最終濃度は50 μg/mLになります。 各ライセートを10 mLピペットで10倍粉砕します。 細胞懸濁液を室温で3分間放置して、解離していない組織がチューブの底に定着できるようにします。 細胞懸濁液を新しい50 mLコニカルチューブに移し、解離していない組織を残します。注:上記の溶解および粉砕ステップは、解離していない組織の量を大幅に制限します。 チューブを300 x g で4°Cで3分間、ブレーキなしで遠心分離します。 上清を吸引し、残りの細胞ペレットを5 mLのMGMに再懸濁します。 ペレットを5 mLピペットで20倍に粉砕します。 5 mL 細胞懸濁液をコーティングされた T25 フラスコにプレートします。 細胞を37°C、5%CO2 でインキュベートし、24時間後に最初に培地を交換して細胞破片を除去します。メモ: 一部のプロトコルでは、72 時間後に最初のメディア交換を推奨しています。このステップの最適化が必要になる場合があります。 細胞が80%コンフルエントになるまで、MGMで48〜72時間ごとに100%の培地交換を実行します(約5〜7日)。メモ: メディアを交換する前に、すべてのメディアを 37 °C に温める必要があります。 4. ミクログリアの分離 混合グリア培養が80%のコンフルエントに達したら、蓋を締め、パラフィンフィルムで密封して振とう用のフラスコを準備します。 混合グリア培養物からミクログリアを除去するには、フラスコを37°Cのインキュベーター内のオービタルシェーカーに水平に固定します。フラスコを15 x g で1時間振とうします。 培地とピペットを取り出し、15 mLのコニカルチューブに入れます。フラスコを3 mLの温かいMGMで2回すすぎ、15 mLのコニカルチューブに洗浄を加えます。これらはミクログリアです。 5 mLの温かく新鮮なMGMを培養フラスコに加えます。 フラスコをパラフィンフィルムで再密封し、フラスコをシェーカーで水平に固定し、15 x g で37°Cで15時間振とうして、アストロサイトからOPCを分離します。注:この手順は一晩で実行できますが、過剰な時間は細胞死を引き起こす可能性があるため、15時間の振とう時間が重要です。 ステップ4.3の上清を遠心分離する。300 x g で3分間、標準プロトコル16 に従ってミクログリアを培養するか、生物学的アッセイに使用します。 5. 希突起膠細胞前駆細胞単離 注意: 最初の分離後にOPCをメッキする場合は、ポリDリジンコーティングされた表面(滅菌プレートまたはカバースリップ)にメッキする必要があります。このセクションを完了する前に、これらの資料を準備してください。 15時間振とうした後、フラスコから上清を取り除き、滅菌済みの100 mmペトリ皿にプレートします。 上清を37°C、5%CO2 で30分間インキュベートし、15分後に旋回させて残りのミクログリアを除去します。非組織培養処理ペトリ皿をこの工程に用いてもよい。 非接着性細胞上清を除去し、カウントし、ポリD-リジンコーティングされた表面上のプレートにします。通常、7,500〜10,000個のOPCがメッキ/ cm2です。 37°C、5%CO2 で少なくとも1時間(最大6時間)インキュベートし、95%の培地を穏やかに吸引し、温かいOPC培地をゆっくりと加え、培地をウェルの壁にピペッティングしてOPCの破壊を最小限に抑えます。細胞が使用可能になるまで、48時間ごとに培地を交換してください。注: 一度に 1 つのウェルのみを交換することが重要です。OPCは敏感であり、特に乾燥条件に耐性がありません。OPC培地へのPDGF-AAの添加は、希突起膠細胞へのOPC成熟を遅らせることである。この因子は、実験の焦点が成熟希突起膠細胞である場合、培地から除外され得る。 6.アストロサイトの分離 15時間振とうした後、上清を取り除き、フラスコを温かい1x PBSで2回すすぎます。 0.53 mM EDTAを含む0.05%トリプシン4 mLを加え、37°C、5%CO2 で5分間、または細胞が持ち上げられるまでインキュベートします。星状細胞が浮き上がったことを確認するには、標準の広視野顕微鏡を使用して星状細胞を視覚化します。アストロサイトは、トリプシン処理後に球状に見えます。 アストロサイトが剥離したら、フラスコを垂直に立て、4 mL MGMを加えます。粉砕して混ぜる。 アストロサイトを15 mLのコニカルチューブにピペットで入れ、300 x g で5分間遠心分離します。 ステップ1.2の説明に従って、アストロサイト培地およびプレートをフィブロネクチンコーティング表面に再懸濁します。または生物学的アッセイに使用します。注:20 ng/mLのマウス線維芽細胞増殖因子は、最初の培地交換時に添加して、星状細胞培養の確立に役立てることができます。さらに、標準的なゼラチンコーティングは、フィブロネクチンの低コストの代替品であり得る。 7. 免疫細胞化学を用いたミクログリア、OPC、アストロサイト、成熟希突起膠細胞の同定と単離 播種した細胞が適切なコンフルエントに達したら、培地を静かに取り除き、4%パラホルムアルデヒド(PFA)を使用して接着細胞を10分間固定します。バイオセーフティキャビネットでこのステップを実行します。注:溶液を吸引または追加するときは、細胞の剥離を防ぐために穏やかな圧力でピペットで留めてください。 PFAをゆっくりと吸引し、細胞を1x PBSで3回5分間洗浄します。 1x PBSで10%血清と0.1%Triton X-100を使用して適切なブロッキング溶液を調製します。注:血清源は、二次抗体が産生された宿主動物を反映しています。例えば、二次抗体がヤギ抗ウサギである場合、適切なブロッキング血清は正常ヤギ血清である。同様に、二次抗体がロバ抗ウサギである場合、ブロッキング血清は正常なロバ血清でなければなりません。 細胞が完全に覆われるまでブロッキング溶液を追加します。室温で1時間ブロックします。 抗体希釈液(1x PBSの9 mL、ウシ血清アルブミン0.01 g、Triton X-10030 μL)を準備します。あるいは、抗体は、ステップ6.3に記載されるブロッキング溶液中で希釈することができる。 以下に特異的な一次抗体を抗体希釈液またはブロッキング溶液で希釈する:ミクログリア:イオン化カルシウム結合アダプター分子1(Iba1)を1:250希釈(2.4 μg/mL)。 OPC:神経/グリア抗原2(NG2)を1:200希釈(5 μg/mL)。 成熟希突起膠細胞:1:400希釈のミエリン塩基性タンパク質(MBP)(濃度はロットに依存し、最適化が必要な場合があります)。 アストロサイト:グリア線維性酸性タンパク質(GFAP)を1:400希釈(0.25 μg/mL)17。注:同じ種で育てられた一次抗体を混合しないでください。注:GFAPは白質星状細胞を確実に標識します。灰白質星状細胞の場合、代替マーカーを使用する必要がある場合があります。 一次抗体を4°Cで一晩インキュベートします(穏やかな攪拌が好ましい)。 1x PBSで3回5分間洗浄し、一次抗体を除去します。 適切な二次抗体を含む細胞を、抗体希釈液または光から保護されたブロッキング溶液中で1:400に希釈してインキュベートします。注:二次抗体は蛍光色素に結合しており、利用可能な顕微鏡パラメータに応じて交換できます。蛍光二次抗体を塗布したら、できるだけ光から保護してください。 二次抗体を室温で1時間インキュベートし、光への曝露を制限します。 1x PBSで5分間3回洗浄して、余分な二次抗体を除去します。 核を標識するには、1:1,000 DAPI/PBS溶液を使用し、暗所で室温で5分間細胞をインキュベートします。 暗闇の中で3x PBSで5分間5x洗浄します。 マウントするには、封入剤を塗布し、暗所で乾かしてからイメージングします。注意: マウントされたスライドは、室温で2〜3日間保存できます。長期保存の場合は、スライドを4°Cに移動します。 最大の信号を得るために1週間以内に画像。すべての代表的な画像は共焦点顕微鏡で画像化されています。ただし、倒立蛍光顕微鏡も推奨されます。