Vorbereitung der Stimmlippe der Ratte für neuromuskuläre Analysen
Summary
Dieses Protokoll beschreibt Methoden zur Vorbereitung von Rattengespinkeln für histochemische neuromuskuläre Studien.
Abstract
Der Zweck dieses Tutorials ist es, die Vorbereitung der Rattengespinstfalte für histochemische neuromuskuläre Studien zu beschreiben. Dieses Protokoll beschreibt Verfahren für die Larynxdissektion von Ratten, das Schockgefrieren und die Kryosektion der Stimmlippen. Diese Studie beschreibt, wie man Stimmlippen sowohl in Längs- als auch in Querschnittsebene kryosektioniert. Eine Neuheit dieses Protokolls ist die Kehlkopfverfolgung während der Kryosektion, die eine genaue Identifizierung der intrinsischen Kehlkopfmuskulatur gewährleistet und die Wahrscheinlichkeit eines Gewebeverlusts verringert. Die Abbildungen zeigen die fortschreitende Kryosektion in beiden Ebenen. Neunundzwanzig Ratten-Hemi-Laryngen wurden kryosektiert und vom Aufkommen des Schilddrüsenknorpels bis zum Erscheinen des ersten Abschnitts verfolgt, der die volle Stimmlippe enthielt. Die volle Stimmlippe wurde für alle Tiere in beiden Ebenen visualisiert. Es gab eine hohe Variabilität im Abstand vom Auftreten des Schilddrüsenknorpels bis zum Auftreten der vollen Stimmlippe in beiden Ebenen. Das Gewicht korrelierte nicht mit der Tiefe der Kehlkopfmarkierungen, was darauf hindeutet, dass die individuelle Variabilität und andere Faktoren im Zusammenhang mit der Gewebepräparation für die hohe Variabilität des Auftretens von Landmarken während des Schneidens verantwortlich sein könnten. Diese Studie beschreibt eine Methodik und präsentiert morphologische Daten zur Vorbereitung der Stimmlippe der Ratte für histochemische neuromuskuläre Untersuchungen. Aufgrund der hohen individuellen Variabilität sollten Kehlkopfmarkierungen während der Kryosektion genau verfolgt werden, um eine Übersektion von Gewebe und Gewebeverlust zu verhindern. Die Verwendung einer konsistenten Methodik, einschließlich einer angemessenen Gewebevorbereitung und des Bewusstseins für Landmarken im Kehlkopf der Ratte, wird zu konsistenten Ergebnissen in allen Studien beitragen und neuen Forschern helfen, die daran interessiert sind, die Stimmlippe der Ratte als Modell zur Untersuchung der neuromuskulären Kehlkopfmechanismen zu verwenden.
Introduction
Der Kehlkopf der Ratte ist ein etabliertes Modell zur Untersuchung struktureller und funktioneller neuromuskulärer Kehlkopfanpassungen an Entwicklung, Alterung, Krankheit und pharmakologische Wirkstoffe1,2,3,4,5. Die Konsistenz histologischer Methoden ist für diese Arbeit von entscheidender Bedeutung, da bei der Muskelvorbereitung und -analyse mehrere Feinheiten beteiligt sind, sowie Herausforderungen im Zusammenhang mit der Größe, Form und Topographie der in den Kehlkopfknorpeln eingekapselten Muskeln1,6,7,8,9,10,11 . Aufgrund der geringen Größe der intrinsischen Kehlkopfmuskulatur der Ratte sind systematisches Einbetten, Einfrieren und Kryosektion entscheidend, um konsistente und genaue Ergebnisse zu erzielen. Wenn beispielsweise die Stimmlippe der Ratte in der koronalen Ebene geschnitten wird, befinden sich die neuromuskulären Verbindungen (NMJs) von vier der intrinsischen Kehlkopfmuskeln innerhalb von weniger als 1,8 mm Gewebetiefe11. Daher ist eine präzise Überwachung der Anatomie der Kehlkopfmuskulatur während der Kryosektion unerlässlich, um die interessierenden Abschnitte genau zu identifizieren und eine Übersektion des Gewebes zu verhindern. Eine Übersektion des Zielmuskels kann zu einer ungenauen Identifizierung der Anzahl und Topographie von NMJs11 oder zu einer Gesamtverringerung der Stichprobengröße führen, wenn der Zielmuskel aufgrund von Orientierungsverwechslungen verworfen wird12. Da neuartige Modelle für die Untersuchung des Kehlkopfmuskels und ihrer jeweiligen Anpassungen entwickelt werden, sind Standardarbeitsanweisungen unerlässlich, um sicherzustellen, dass die Ergebnisse in allen Studien präzise, zuverlässig und reproduzierbar sind.
Ziel dieses Artikels ist es, die Vorbereitung der Stimmlippe der Ratte für eine optimale Längs- und Querschnittsanalyse detailliert zu beschreiben. Detaillierte Methoden, die regelmäßig in unserem Labor angewendet werden, werden beschrieben, um Zielmuskelmarker während der Kryosektion zu identifizieren. Obwohl ähnliche Methoden in mehreren Labors verwendet werden, werden hier mehr Details als in der Literatur bereitgestellt, um eine zuverlässige und genaue Replikation zu gewährleisten, wenn sie von unerfahrenen Forschern implementiert wird. Ziel dieses Tutorials ist es, eine Standardmethodik für die immunhistochemische (IHC) Bewertung der Rattengespinstfalte bereitzustellen, um die Konsistenz zwischen Labors und Untersuchungen zu verbessern.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Vorbereitung der Stimmlippen von Ratten für die neuromuskuläre Analyse kann verschiedene Herausforderungen mit sich bringen. Die Kehlkopfmuskulatur ist nicht nur klein und von Knorpel umgeben, was es schwierig macht, den Zielmuskel direkt zu extrahieren, sondern es wurde auch eine hohe Variabilität zwischen Tieren in der Tiefe der anatomischen Kehlkopfmarkierungen festgestellt. Für das Protokoll der Querschnittsebene des Muskels traten vollständige Stimmlippenabschnitte zwischen 21-85 Abschnitten (10 μm pro Abs…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Forschung wurde durch die Zuschüsse F31DC017053-01A1 (Lenell, PI) und K23DC014517 (Johnson, PI) des National Institute on Deafness and other Communication Disorders der National Institutes of Health unterstützt.
Materials
| 2-Methylbutane Certified | Fisher Chemical | 35514 | |
| Aluminum Foil | Fisherbrand | 1213101 | |
| Cryo Tongs SS | Thermo Scientific | 11679123 | |
| Cryostat | Leica Biosystems | CM3050 | |
| Cryostat blades | C.L. Sturkey D554X50 | 22-210-045 | |
| Disposable Base Molds 15mm x 15mm | Thermo Scientific | 41-741 | |
| Disposable Underpads | Medline | 23-666-062 | |
| Dissection kit | Thermo Scientific | 9996969 | |
| DPBS – Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Gibco | 14190136 | |
| Frozen Section Medium | Fisher Healthcare | 23-730-571 | |
| Ice Bucket | Bel-Art | 11999054 | |
| Immunostain Moisture Chamber | Ted Pella Inc | NC9425474 | |
| Needle holders | Assi | ASSI.B148 | |
| Non-Woven Sponges, 4 Ply | Quick Medical | 9023 | |
| Orbital shaker | Troemner | 02-217-987 | |
| Pap pen | |||
| Paraformaldehyde, 16% w/v aq. soln., methanol free | Alfa Aesar | 50-00-0 | |
| Premium Microcentrifuge Tubes | Fisherbrand | 5408129 | |
| Specimen Storage Bags | Fisherbrand | 19240093 | |
| Stainless Steel Graduated Measure 32 oz/100 mL | Polar Ware | 114231B | |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Task wiper | Kimberly-Clark Professional™ 34155 | 06666A | |
| Timer | Fisherbrand | 2261840 | |
| Vannas Pattern Scissors | Assi | ASSI.SAS15RV | |
| NOTE: For all supplies, these are examples of equipment to purchase. The exact model is not necessary to complete our methods. | |||
References
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