Summary

Doppia iniezione diretta di sangue nella Cisterna Magna come modello di emorragia subarachnoide

Published: August 30, 2020
doi:

Summary

Abbiamo descritto in questo protocollo un modello di topo standardizzato di emorragia subarnoide (SAH) con una doppia iniezione di sangue intero autologo nella cisterna magna. L’elevato grado di standardizzazione della procedura a doppia iniezione rappresenta un modello medio-acuto di SAH con relativa sicurezza per quanto riguarda la mortalità.

Abstract

Tra i ictus, l’emorragia subaracnoidea (SAH) consecutiva alla rottura di un aneurisma arteriosa cerebrale rappresenta il 5-9%, ma è responsabile di circa il 30% della mortalità totale correlata all’ictus con un’importante morbilità in termini di esito neurologico. Un vasospasma cerebrale ritardato (CVS) può verificarsi più spesso in associazione con un’ischemia cerebrale ritardata. Diversi modelli animali di SAH sono ora utilizzati tra cui perforazione endovascolare e iniezione diretta di sangue nella cisterna magna o anche la cisterna prechiasmatica, ognuna con vantaggi e svantaggi distinti. In questo articolo, viene presentato un modello di topo standardizzato di SAH mediante doppia iniezione diretta di volumi determinati di sangue intero autologo nella cisterna magna. In breve, i topi sono stati pesati e poi anetiti con inalazione isoflurana. Poi, l’animale è stato posto in una posizione reclinata su una coperta riscaldata mantenendo una temperatura rettale di 37 gradi centigradi e posizionato in un telaio stereotattico con una curva cervicale di circa 30 gradi. Una volta in posizione, la punta di una micropipetta di vetro allungata riempita con il sangue arterioso omologato prelevato dall’arteria carotidea di un altro topo della stessa età e sesso (C57Bl/6J) è stata posizionata ad angolo retto a contatto con la membrana alanto-occipitale per mezzo di un micromanipolatore. Poi 60 L di sangue è stato iniettato nella cisterna magna seguita da un’inclinazione verso il basso di 30 gradi dell’animale per 2 minuti. La seconda infusione di 30 L di sangue nella cisterna magna è stata eseguita 24 h dopo la prima. Il follow-up individuale di ogni animale viene effettuato giornalmente (attenta valutazione del peso e del benessere). Questa procedura consente una distribuzione prevedibile e altamente riproducibile del sangue, probabilmente accompagnata da un’elevazione della pressione intratrattale che può essere imitata da un’iniezione equivalente di un fluido spinale cerebrale artificiale (CSF), e rappresenta un modello acuto a lieve di SAH che induce una bassa mortalità.

Introduction

L’emorragia subarachnoide (SAH) rappresenta fino al 5% di tutti i casi di ictus e costituisce una patologia relativamente comune con un’incidenza di 7,2-9 pazienti ogni 100.000all’anno,con un tasso di mortalità del 20%-60% a seconda dello studio1,2,3 . Nella fase acuta, la mortalità è attribuibile alla gravità del sanguinamento, del sanguinamento, del vasospasmo cerebrale (CVS) e/o delle complicazioni mediche4. Nei sopravvissuti, la lesione cerebrale precoce (EBI) è associata all’estensione parenchimale dell’emorragia e al brusco aumento della pressione intratrattale, che può provocare ischemia cerebraleprimaria 5 e morte immediata in circa il 10%-15% dei casi6. Dopo lo stadio “acuto” iniziale di SAH, la prognosi dipende dall’insorgenza di ischemia cerebrale “secondaria” o ritardata (DCI), rilevata in quasi il 40% dei pazienti dalla tomografia computerizzata cerebrale e in fino all’80% dei pazienti dopo la risonanza magnetica(RMI) 7,8. Oltre al CVS che si verifica tra 4 e 21 giorni dopo la rottura dell’aneurisma nella maggior parte dei pazienti affetti da SAH, la DCI9 può derivare da lesioni cerebrali diffuse multifattoriali secondarie alla formazione di microtrombosi, ridotta perfusione cerebrale, neuroinfiammazione e depressione corticale (CSD)10,11,12,13. Questo colpisce il 30% dei sopravvissuti SAH e influisce sulle funzioni cognitive, tra cui la memoria visiva, la memoria verbale, il tempo di reazione e le funzioni esecutive, visuospatiali elinguistiche 14 che compromettono la vitaquotidiana 15. Le attuali terapie standard per prevenire il CVS e/o gli scarsi risultati cognitivi nei pazienti affetti da SAH si basano sul blocco della segnalazione e della vasoconstriction di Ca2 utilizzandoinibitori del canale Ca 2 come Nimodipine. Tuttavia, studi clinici più recenti mirati alla vasoconstriction hanno rivelato la dissociazione tra l’esito neurologico del paziente e la prevenzione del CVS16, suggerendo meccanismi patofisiologici più complessi coinvolti nelle conseguenze a lungo termine di SAH. Pertanto, vi è una necessità medica di una maggiore comprensione del numero di eventi patologici che accompagnano SAH e lo sviluppo di modelli animali validi e standardizzati per testare gli interventi terapeutici originali.

La rottura di un aneurisma intracranico per lo più responsabile di SAH negli esseri umani è probabilmente difficile da imitare nei modelli animali preclinici. Attualmente, la rottura dell’aneurisma e la situazione SAH possono essere provvisoriamente testati dalla perforazione dell’arteria cerebrale media (modello di puntura endovascolare) responsabile delle disfunzioni CVS e sensibilizzanti neitopi 17,18. A causa della mancanza di un possibile controllo sull’insorgenza del sanguinamento e della diffusione del sangue in questo modello, sono stati sviluppati altri metodi nei roditori per generare modelli SAH senza rottura endovascolare. Più precisamente, consistono nella somministrazione diretta di sangue arteriosa nello spazio subarachnoid attraverso una singola o una doppia iniezione nella magna cisterna19 o una singola iniezione nella cisterna prechiastmatica20. Il vantaggio principale di questi modelli murini senza rottura endovascolare è la possibilità di padroneggiare in modo riproducibile la procedura chirurgica e la qualità e la quantità del campione di sangue iniettato. Un altro vantaggio di questo modello rispetto al modello mediante perforazione endovascolare in particolare è la conservazione del benessere generale dell’animale. Infatti, questa chirurgia è meno invasiva e tecnicamente meno impegnativa di quella necessaria per generare una rottura della parete carotide. In quest’ultimo modello, l’animale deve essere intubato e ventilato meccanicamente, mentre un monofilamento viene inserito nell’arteria carotide esterna e avanzato nell’arteria carotidea interna. Questo probabilmente porta a ischemia transitoria a causa di ostruzione del vaso dal percorso di filo. Di conseguenza, la co-morbidità (stato moribondo, dolore importante e morte) associata alla chirurgia è meno importante nel modello di doppia iniezione rispetto al modello di perforazione endovascolare. Oltre ad essere un SAH più coerente, il metodo di doppia iniezione diretta è conforme al benessere degli animali nella ricerca e nei test (riduzione del tempo in anestesia, dolore da interruzione dei tessuti in chirurgia e disagio) e porta ad un numero totale minimo di animali utilizzati per lo studio del protocollo e la formazione del personale.

Inoltre, ciò consente l’implementazione dello stesso protocollo ai topi transgenici, portando ad una comprensione patologica ottimizzata del SAH e alla possibilità di test comparativi di potenziali composti terapeutici. Qui, presentiamo un modello di topo standardizzato di emorragia subarnoide (SAH) con una doppia iniezione consecutiva giornaliera di sangue arterioso autologo nella cisterna magna in topi maschi C57Bl/6J maschi di 6-8 settimane. Il vantaggio principale di questo modello è il controllo del volume di sanguinamento rispetto al modello di perforazione endovascolare, e il rafforzamento dell’evento di sanguinamento senza un drastico aumento della pressione intraranziale21. Recentemente, la doppia iniezione diretta di sangue nella cisterna magna è stata ben descritta sui problemi sperimentali e fisiologici nei topi. Infatti, abbiamo recentemente dimostrato CVS di grandi arterie cerebrali (basilar (BA), intermedie (MCA) e arterie cerebrali anteriore (ACA), deposizione di fibrina cerebrovascolare e apoptosi cellulare dal giorno 3 (D3) al 10 (D10), difetti di circolazione del liquido cerebrobroale paravascolare accompagnato da alterate funzioni sensibilizzanti e cognitive nei topi, 10 giorni dopo SAH in questo modello22. Così, rende questo modello padroneggiato, convalidato e caratterizzato per eventi a breve termine e di lunga durata post-SAH. Dovrebbe essere ideale per l’identificazione prospettiche di nuovi obiettivi e per gli studi su strategie terapeutiche potenti ed efficienti contro le complicanze associate al SAH.

Protocol

Tutte le procedure sono state eseguite sotto la supervisione di H. Castel in conformità con il Comitato etico francese e le linee guida della direttiva 2010/63/UE del Parlamento europeo e del Consiglio per la protezione degli animali utilizzati per scopi scientifici. Questo progetto è stato approvato dal CENOMEXA locale e dai comitati nazionali di etica per la ricerca e la sperimentazione sugli animali. I topi maschi C57Bl/6J Rj (Janvier), di età compresa tra 8 e 12 settimane, erano alloggiati in condizioni ambientali…

Representative Results

Sequenza temporale sperimentale, procedura, follow-up e mortalitàFigura 1A e Figura 1B riepilogare il protocollo del modello SAH mediante doppia iniezione intracisterna di sangue. In breve, il primo giorno di induzione di SAH (D-1), 60 L di sangue prelevato da un topo omologa o 60 L di liquido cerebrospinale artificiale (aCSF) sono stati iniettati nella cisterna magna in SAH o condizioni di finzione, rispettivamente. Il giorno successivo (D…

Discussion

Nonostante l’intensità della ricerca nel campo della SAH e lo sviluppo di strategie terapeutiche come le opzioni di trattamento endovascolare e farmacologico in aumento negli ultimi vent’anni, la mortalità rimane elevata entro la prima settimana di ricovero ospedaliero e raggiunge circa il 50% nei successivi 6 mesi24,25. Questo modello preclinico attuale da doppia iniezione giornaliera di sangue arterioso omologa nella cisterna magna è stato r…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ringraziamo la piattaforma PRIMACEN (Normandie Rouen University, Francia) per le apparecchiature di imaging e Arnaud Arabo, la signora Julie Maucotel e la signora Martine Dubois, per l’alloggio e la cura degli animali. Ringraziamo la signora Celeste Nicola per aver prestato la sua voce alle riprese del protocollo. Questo lavoro è stato sostenuto dal programma di maturazione Seinari Normandy, Fondation AVC sotto l’egida della FRM, Normandie Rouen University e Inserm. La regione della Normandia e l’Unione europea (progetto 3R). L’Europa è coinvolta in Normandia con il Fondo europeo di sviluppo regionale (ERDF).

Materials

absorbable hemostat Ethicon Surgicel
absorbable suturing thread Ethicon Vicryl 5.0
auto-regulated electric blanket Harvard Apparatus 50-7087-F
bluetack for capillary fixation UHU Patafix
electronic balance Denver Instrument MXX-2001
glass capillaries Harvard Apparatus GC150F-15 inner diameter 0.86 mm
outer diameter 1.5 mm
isoflurane vaporizer Phymep V100
micropipette puller Sutter Instrument Company P-97
needle 26 G BD microbalance 300300
non absorbable suturing thread Peters surgical Filapeau 4.0
stereotaxic frame David Kopf instruments Model 902
surgical equipment Kent scientific clamp, microscissors, thin scissors
syringe 20 mL TERUMO Thermofisher 11866071

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Cite This Article
Pedard, M., El Amki, M., Lefevre-Scelles, A., Compère, V., Castel, H. Double Direct Injection of Blood into the Cisterna Magna as a Model of Subarachnoid Hemorrhage. J. Vis. Exp. (162), e61322, doi:10.3791/61322 (2020).

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