Doppia iniezione diretta di sangue nella Cisterna Magna come modello di emorragia subarachnoide

L’emorragia subarachnoide (SAH) rappresenta fino al 5% di tutti i casi di ictus e costituisce una patologia relativamente comune con un’incidenza di 7,2-9 pazienti ogni 100.000^all’anno,con un tasso di mortalità del 20%-60% a seconda dello studio^1,2,3 . Nella fase acuta, la mortalità è attribuibile alla gravità del sanguinamento, del sanguinamento, del vasospasmo cerebrale (CVS) e/o delle complicazioni mediche⁴. Nei sopravvissuti, la lesione cerebrale precoce (EBI) è associata all’estensione parenchimale dell’emorragia e al brusco aumento della pressione intratrattale, che può provocare ischemia cerebrale^{primaria 5} e morte immediata in circa il 10%-15% dei casi⁶. Dopo lo stadio “acuto” iniziale di SAH, la prognosi dipende dall’insorgenza di ischemia cerebrale “secondaria” o ritardata (DCI), rilevata in quasi il 40% dei pazienti dalla tomografia computerizzata cerebrale e in fino all’80% dei pazienti dopo la risonanza magnetica^{(RMI) 7,8}. Oltre al CVS che si verifica tra 4 e 21 giorni dopo la rottura dell’aneurisma nella maggior parte dei pazienti affetti da SAH, la DCI⁹ può derivare da lesioni cerebrali diffuse multifattoriali secondarie alla formazione di microtrombosi, ridotta perfusione cerebrale, neuroinfiammazione e depressione corticale (CSD)^10,11,12,13. Questo colpisce il 30% dei sopravvissuti SAH e influisce sulle funzioni cognitive, tra cui la memoria visiva, la memoria verbale, il tempo di reazione e le funzioni esecutive, visuospatiali e^{linguistiche 14 che} compromettono la vita^{quotidiana 15}. Le attuali terapie standard per prevenire il CVS e/o gli scarsi risultati cognitivi nei pazienti affetti da SAH si basano sul blocco della segnalazione e della vasoconstriction di Ca² utilizzando^{inibitori del} canale Ca 2 come Nimodipine. Tuttavia, studi clinici più recenti mirati alla vasoconstriction hanno rivelato la dissociazione tra l’esito neurologico del paziente e la prevenzione del CVS¹⁶, suggerendo meccanismi patofisiologici più complessi coinvolti nelle conseguenze a lungo termine di SAH. Pertanto, vi è una necessità medica di una maggiore comprensione del numero di eventi patologici che accompagnano SAH e lo sviluppo di modelli animali validi e standardizzati per testare gli interventi terapeutici originali.

La rottura di un aneurisma intracranico per lo più responsabile di SAH negli esseri umani è probabilmente difficile da imitare nei modelli animali preclinici. Attualmente, la rottura dell’aneurisma e la situazione SAH possono essere provvisoriamente testati dalla perforazione dell’arteria cerebrale media (modello di puntura endovascolare) responsabile delle disfunzioni CVS e sensibilizzanti nei^{topi 17,18}. A causa della mancanza di un possibile controllo sull’insorgenza del sanguinamento e della diffusione del sangue in questo modello, sono stati sviluppati altri metodi nei roditori per generare modelli SAH senza rottura endovascolare. Più precisamente, consistono nella somministrazione diretta di sangue arteriosa nello spazio subarachnoid attraverso una singola o una doppia iniezione nella magna cisterna¹⁹ o una singola iniezione nella cisterna prechiastmatica²⁰. Il vantaggio principale di questi modelli murini senza rottura endovascolare è la possibilità di padroneggiare in modo riproducibile la procedura chirurgica e la qualità e la quantità del campione di sangue iniettato. Un altro vantaggio di questo modello rispetto al modello mediante perforazione endovascolare in particolare è la conservazione del benessere generale dell’animale. Infatti, questa chirurgia è meno invasiva e tecnicamente meno impegnativa di quella necessaria per generare una rottura della parete carotide. In quest’ultimo modello, l’animale deve essere intubato e ventilato meccanicamente, mentre un monofilamento viene inserito nell’arteria carotide esterna e avanzato nell’arteria carotidea interna. Questo probabilmente porta a ischemia transitoria a causa di ostruzione del vaso dal percorso di filo. Di conseguenza, la co-morbidità (stato moribondo, dolore importante e morte) associata alla chirurgia è meno importante nel modello di doppia iniezione rispetto al modello di perforazione endovascolare. Oltre ad essere un SAH più coerente, il metodo di doppia iniezione diretta è conforme al benessere degli animali nella ricerca e nei test (riduzione del tempo in anestesia, dolore da interruzione dei tessuti in chirurgia e disagio) e porta ad un numero totale minimo di animali utilizzati per lo studio del protocollo e la formazione del personale.

Inoltre, ciò consente l’implementazione dello stesso protocollo ai topi transgenici, portando ad una comprensione patologica ottimizzata del SAH e alla possibilità di test comparativi di potenziali composti terapeutici. Qui, presentiamo un modello di topo standardizzato di emorragia subarnoide (SAH) con una doppia iniezione consecutiva giornaliera di sangue arterioso autologo nella cisterna magna in topi maschi C57Bl/6J maschi di 6-8 settimane. Il vantaggio principale di questo modello è il controllo del volume di sanguinamento rispetto al modello di perforazione endovascolare, e il rafforzamento dell’evento di sanguinamento senza un drastico aumento della pressione intraranziale²¹. Recentemente, la doppia iniezione diretta di sangue nella cisterna magna è stata ben descritta sui problemi sperimentali e fisiologici nei topi. Infatti, abbiamo recentemente dimostrato CVS di grandi arterie cerebrali (basilar (BA), intermedie (MCA) e arterie cerebrali anteriore (ACA), deposizione di fibrina cerebrovascolare e apoptosi cellulare dal giorno 3 (D3) al 10 (D10), difetti di circolazione del liquido cerebrobroale paravascolare accompagnato da alterate funzioni sensibilizzanti e cognitive nei topi, 10 giorni dopo SAH in questo modello²². Così, rende questo modello padroneggiato, convalidato e caratterizzato per eventi a breve termine e di lunga durata post-SAH. Dovrebbe essere ideale per l’identificazione prospettiche di nuovi obiettivi e per gli studi su strategie terapeutiche potenti ed efficienti contro le complicanze associate al SAH.