Bu protokol, aynı kemirgen beyin örnekleri kümesinde iskemik beyin hasarının en önemli üç parametresini ölçmenin yeni bir tekniğini açıklar. Sadece bir beyin örneği kullanmak etik ve ekonomik maliyetler açısından oldukça avantajlıdır.
Dünya genelinde morbidite ve mortalitenin en sık nedenlerinden biri iskemik inmedir. Tarihsel olarak, iskemik inmeyi uyarmak için kullanılan bir hayvan modeli orta serebral arter tıkanıklığını (MCAO) içerir. Enfarktüs bölgesi, beyin ödemi ve kan-beyin bariyeri (BBB) bozulması MCAO sonrası beyin hasarının boyutunu yansıtan parametreler olarak ölçülür. Bu yöntemin önemli bir sınırlaması, bu ölçümlerin normalde farklı sıçan beyin örneklerinde elde edilmesi ve uygun bir örnek boyutu için ötenazi yapılması gereken çok sayıda sıçan nedeniyle etik ve finansal yüklere yol açtır. Burada, aynı sıçan beyin kümesinde enfarktüs bölgesini, beyin ödemini ve BBB geçirgenliğini ölçerek MCAO’yu takiben beyin hasarının doğru bir şekilde değerlendirilmesi için bir yöntem sunuyoruz. Bu yeni teknik, inmenin patofizyolojisini değerlendirmek için daha verimli bir yol sağlar.
Dünya genelinde morbidite ve mortalitenin en sık nedenlerinden biri inmedir. Küresel olarak, iskemik inme tüm inme vakalarının% 68’ini temsil ederken, Amerika Birleşik Devletleri’nde iskemik inme, inme vakalarının% 87’sini oluşturur1,2. İnmenin ekonomik yükünün Amerika Birleşik Devletleri’nde2 ve Avrupa Birliği’nde 45 milyar Euro’ya ulaştığı tahmin edilmektedir3. İnmenin hayvan modelleri patofizyolojisini incelemek, değerlendirme için yeni yöntemler geliştirmek ve yeni terapötik seçenekler önermek için gereklidir4.
İskemik inme, genellikle orta serebral arter veya dallarından biri olan majör bir serebral arterin tıkanması ile ortaya çıkar5. Bu nedenle, iskemik inme modelleri tarihsel olarak orta serebral arter tıkanıklığını (MCAO)6, 7,8,9,10,11,12‘yikapsamıştır. MCAO’yu takip ederek, nörolojik yaralanma en sık 2,3,5-triphenyltetrazolium klorür (TTC) boyama yöntemi13, beyin ödemi (BE) kullanılarak enfarktüs bölgesi (IZ) ölçülerek değerlendirilir. ) Evans mavi boyama17 , 18,19kullanarak bir spektrometre tekniği ile kurutma veya hesaplama hemisferik hacimleri 14 , 15,16vekan beyin bariyeri (BBB) geçirgenliği kullanarak.
Geleneksel MCAO yöntemi, üç beyin ölçümünün her biri için ayrı beyin kümeleri kullanır. Büyük bir örneklem boyutu için, bu, ek etik ve finansal hususlarla birlikte önemli sayıda ötenaziye tabi hayvanla sonuçlanır. Bu maliyetleri hafifletmek için alternatif bir yöntem, MCAO sonrası kemirgen beyinlerinin tek bir kümesindeki üç parametrenin de ölçümünü içerecektir.
Aynı beyin örneğindeki parametrelerin kombinasyonlarını ölçmek için önceki girişimler yapılmıştır. Aynı beyin örneğinde TTC lekelemeden sonra eşzamanlı immünoresan boyama yöntemleri20 ve diğer moleküler ve biyokimyasal analizler21 tanımlanmıştır. Daha önce beyin ödemini değerlendirmek için beyin yarımküre hacimlerini hesapladık ve aynı beyin setinde enfarktüs bölgesini hesaplamak için TTC boyama yaptık15.
Mevcut protokolde, aynı kemirgen beyin kümesinde IZ, BE ve BBB geçirgenliğini belirleyerek iskemik beyin hasarını ölçen değiştirilmiş bir MCAO tekniği sunuyoruz. IZ TTC boyama ile ölçülür, BE yarım küre hacmi hesaplanarak belirlenir ve BBB geçirgenliği spektrometre yöntemleri ile elde edilir19. Bu protokolde, monofilament kateterin iç karotid artere (ICA) doğrudan yerleştirilmesine ve sabitlenmesine ve orta serebral artere (MCA) kan akışının daha fazla engellenmesine dayanan modifiye bir MCAO modeli kullandık22. Bu değiştirilmiş yöntem, geleneksel MCAO yöntemi16,22’yekıyasla ölüm ve morbidite oranının azaldığını göstermektedir.
Bu yeni yaklaşım, MCAO’dan sonra nörolojik hasarı ölçmek için finansal açıdan sağlam ve etik bir model sunmaktadır. İskemik beyin hasarının ana parametrelerinin bu değerlendirmesi, patofizyolojisinin kapsamlı bir şekilde araştırılmasına yardımcı olacaktır.
Mevcut protokolün temel amacı, iskemik yaralanmanın üç ana parametresinin tutarlı ölçümlerini göstermekti: IZ, BE ve BBB geçirgenliği. Bu alanda daha önce yapılan çalışmalar, bu parametrelerden bir veya ikisinin aynı örnekte birlikte gerçekleştirilme olasılığını ortaya koymuştur. Bu üç parçalı yöntemin sunduğu maliyet azaltmanın yanı sıra, ameliyat edilmesi ve daha sonra ötenazi yapılması gereken hayvan sayısını sınırlayan daha arzu edilen bir biyoetik model de sağlar. Tüm hi…
The authors have nothing to disclose.
Maryna Kuscheriava, Maksym Kryvonosov, Daryna Yakumenko ve Fizyoloji Bölümü, Biyoloji, Ekoloji ve Tıp Fakültesi Evgenia Goncharyk, Oles Honchar, Dnipro Üniversitesi, Dnipro, Ukrayna’ya görüşmelerimize destekleri ve yararlı katkıları için teşekkür ederiz. Elde edilen veriler Ruslan Kuts’un doktora tezinin bir parçasıdır.
2 mL Syringe | Braun | 4606027V | |
2% chlorhexidine in 70% alcohol solution | Sigma-Aldrich | 500 cc | Provides general antisepsis of the skin in the operatory field |
27 G Needle with Syringe | Braun | 305620 | |
3-0 Silk sutures | Henry Schein | 1007842 | |
4-0 Nylon suture | 4-00 | ||
Brain & Tissue Matrices | Sigma-Aldrich | 15013 | |
Cannula Venflon 22 G | KD-FIX | 183603985447 | |
Centrifuge Sigma 2-16P | Sigma-Aldrich | Sigma 2-16P | |
Compact Analytical Balances | Sigma-Aldrich | HR-AZ/HR-A | |
Digital weighing scale | Sigma-Aldrich | Rs 4,000 | |
Dissecting scissors | Sigma-Aldrich | Z265969 | |
Eppendorf pipette | Sigma-Aldrich | Z683884 | |
Eppendorf tube | Sigma-Aldrich | EP0030119460 | |
Fluorescence detector | Tecan, Männedorf Switzerland | Model: Infinite 200 PRO multimode reader | Optional. |
Fluorescence detector | Molecular Devices LLC | VWR cat. # 10822 512 SpectraMax Paradigm Multi Mode Microplate Reader Base Instrument | Optional. |
Gauze sponges | Fisher | 22-362-178 | |
Heater with thermometer | Heatingpad-1 | Model: HEATINGPAD-1/2 | |
Hemostatic microclips | Sigma-Aldrich | ||
Horizon-XL | Mennen Medical Ltd | ||
Infusion cuff | ABN | IC-500 | |
Micro forceps | Sigma-Aldrich | ||
Micro scissors | Sigma-Aldrich | ||
Multiset | Teva Medical | 998702 | |
Olympus BX 40 microscope | Olympus | ||
Operating forceps | Sigma-Aldrich | ||
Operating scissors | Sigma-Aldrich | ||
Optical scanner | Canon | Cano Scan 4200F | Resolution 3200 x 6400 dpi |
Petri dishes | Sigma-Aldrich | P5606 | |
Purina Chow | Purina | 5001 | Rodent laboratory chow given to rats, mice and hamster is a life-cycle nutrition that has been used in biomedical research for over 5 decades. Provided to rats ad libitum in this experiment. |
Rat cages | Techniplast | 2000P | Conventional housing for rodents. Cages were used for housing rats throughout the experiment |
Scalpel blades #11 | Sigma-Aldrich | S2771 | |
Software | |||
Adobe Photoshop CS2 for Windows | Adobe | ||
ImageJ 1.37v | NIH | The source code is freely available. The author, Wayne Rasband (wayne@codon.nih.gov), is at the Research Services Branch, National Institute of Mental Health, Bethesda, Maryland, USA | |
Office 365 ProPlus | Microsoft | – | Microsoft Office Excel |
Windows 10 | Microsoft | ||
Reagents | |||
2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride | Sigma-Aldrich | 298-96-4 | |
50% trichloroacetic acid | Sigma-Aldrich | 76-03-9 | |
Ethanol 96 % | Romical | Flammable liquid | |
Evans blue 2% | Sigma-Aldrich | 314-13-6 | |
Isoflurane, USP 100% | Piramamal Critical Care, Inc | NDC 66794-017 |