Summary

げっ歯類の脳サンプルの単一のセットで脳卒中後脳浮腫、梗塞ゾーンおよび血液脳関門破壊を測定する

Published: October 23, 2020
doi:

Summary

このプロトコルは、げっ歯類の脳サンプルの同じセット上の虚血性脳損傷の3つの最も重要なパラメータを測定する新しい技術を記述する。1つの脳サンプルのみを使用することは、倫理的および経済的コストの面で非常に有利である。

Abstract

世界的に罹患率と死亡率の最も一般的な原因の1つは虚血性脳卒中である。歴史的に、虚血性脳卒中を刺激するために使用される動物モデルは、中大脳動脈閉塞(MCAO)を含む。梗塞領域、脳浮腫および血液脳関門(BBB)の内訳は、MCAO後の脳損傷の程度を反映するパラメータとして測定される。この方法の重要な制限は、これらの測定は通常、異なるラットの脳サンプルで得られ、適切なサンプルサイズのために安楽死させられる必要がある多数のラットのために倫理的および財政的負担を引き起こします。ここでは、同じラット脳の中で梗塞領域、脳浮腫およびBBB透過性を測定することによってMCAOに続く脳損傷を正確に評価する方法を提示する。この新しい技術は、脳卒中の病態生理を評価するより効率的な方法を提供する。

Introduction

世界的に罹患率と死亡率の最も一般的な原因の1つは脳卒中です。世界的に、虚血性脳卒中は全脳卒中症例の68%を占め、米国では虚血性脳卒中が脳卒中症例1,2の87%を占める。脳卒中の経済的負担は、米国では240億ドル、欧州連合(EU)では450億ユーロに達すると推定されています。脳卒中の動物モデルは、その病態生理学を研究し、評価のための新しい方法を開発し、新しい治療オプションを提案するために必要です4.

虚血性脳卒中は、大脳動脈の閉塞で起こり、通常は中大脳動脈またはその枝の1つである5。したがって、虚血性脳卒中のモデルは、歴史的に中大脳動脈閉塞(MCAO)6、7、8、9、10、11、12を含む。MCAOに続いて、 神経損傷は、2,3,5トリフェニルテトラゾリウムクロリド(TTC)染色法13、脳浮腫(BE)を乾燥または半球14、15、16、および血液脳関門(BBB)透過性を、エバンスブルー17を用いた透過性を測定することによって最も一般的に評価される。

従来のMCAO法は、3つの脳の測定のそれぞれのために別々の脳のセットを使用しています。サンプルサイズが大きい場合、これは、倫理的および財政的な考慮事項を追加して、安楽死させた動物のかなりの数になります。これらのコストを軽減する別の方法は、MCAO後げっ歯類の脳の単一のセットで3つのパラメータすべての測定を含むであろう。

以前の試みは、同じ脳サンプル内のパラメータの組み合わせを測定するために行われています.同時免疫蛍光染色法20 は、他の分子及び生化学的分析21 と同様に、同じ脳試料中でTTC染色後に記載されている。我々は以前に脳浮腫を評価するために脳半球の体積を計算し、同じ脳セット15で梗塞領域を計算するためにTTC染色を行った。

本プロトコルでは、同じ齧歯類脳の中でIZ、BE、BBB透過性を判定することで虚血性脳損傷を測定する改変MCAO技術を提示する。IZはTTC染色法により測定され、BEは半球体積を算出して求められ、BBB透過性は分光法19により得られる。このプロトコルでは、内部頸動脈(ICA)へのモノフィラメントカテーテルの直接挿入および固定に基づく改変MCAOモデルを用いた、および中大脳動脈(MCA)22への血流のさらなる遮断を用いた。この修飾方法は、従来のMCAO法16,22と比較して死亡率および罹患率の低下率示す。

この新しいアプローチは、MCAO後の神経損傷を測定するための財政的に健全で倫理的なモデルを提供します。虚血性脳損傷の主なパラメータのこの評価は、その病態生理学を包括的に調査するのに役立ちます。

Protocol

以下の手順は、ヘルシンキ宣言及び東京宣言及び欧州共同体の実験動物使用に関するガイドラインに従って行われた。実験はまた、ネゲブのベングリオン大学で動物ケア委員会によって承認されました. 実験手順のための1.ラットの準備 成人オスのスプレイグ・ドーリーラットを、あから過ぎの病理を伴わず、それぞれ300〜350gの重さを選択する。 実験前に…

Representative Results

梗塞ゾーン測定 独立サンプルt-テストでは、永久的MCAOを受けた19匹のラットが、3.57ラット対シャム=0.31%± ±1.9、t(28.49)=7.56、p<0.01(図2)と比較して脳梗塞容積が有意に増加したことを示した(図2A)。データは、SDの反側半球±平均パーセントとして表されます。 脳浮腫測定 ?…

Discussion

本プロトコルの主な目標は、虚血性損傷の3つの主要なパラメータの一貫した測定を実証することであった:IZ、BEおよびBBB透過性。この分野の以前の研究は、同じサンプルでこれらのパラメータの1つまたは2つを一緒に実行する可能性を実証しました。この3部構成の方法が提供するコスト削減に加えて、手術とその後の安楽死化しなければならない動物の数を制限するより望ましい生物倫理モ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

マリナ・クシェリアヴァ、マクシム・クリヴォノソフ、ダリーナ・ヤクメンコ、エフゲニア・ゴンチャリク生物学・生態学・医学部、オレス・ホンチャリク、ドニプロ大学、ドニプロ、ウクライナの皆様のご支援、そして私たちの議論への貢献に感謝します。得られたデータは、ルスラン・クッツ博士課程の一部です。

Materials

2 mL Syringe Braun 4606027V
2% chlorhexidine in 70% alcohol solution Sigma-Aldrich 500 cc Provides general antisepsis of the skin in the operatory field
27 G Needle with Syringe Braun 305620
3-0 Silk sutures Henry Schein 1007842
4-0 Nylon suture 4-00
Brain & Tissue Matrices Sigma-Aldrich 15013
Cannula Venflon 22 G KD-FIX 183603985447
Centrifuge Sigma 2-16P Sigma-Aldrich Sigma 2-16P
Compact Analytical Balances Sigma-Aldrich HR-AZ/HR-A
Digital weighing scale Sigma-Aldrich Rs 4,000
Dissecting scissors Sigma-Aldrich Z265969
Eppendorf pipette Sigma-Aldrich Z683884
Eppendorf tube Sigma-Aldrich EP0030119460
Fluorescence detector Tecan, Männedorf Switzerland Model: Infinite 200 PRO multimode reader Optional.
Fluorescence detector Molecular Devices LLC VWR cat. # 10822 512 SpectraMax Paradigm Multi Mode Microplate Reader Base Instrument Optional.
Gauze sponges Fisher 22-362-178
Heater with thermometer Heatingpad-1 Model: HEATINGPAD-1/2
Hemostatic microclips Sigma-Aldrich
Horizon-XL Mennen Medical Ltd
Infusion cuff ABN IC-500
Micro forceps Sigma-Aldrich
Micro scissors Sigma-Aldrich
Multiset Teva Medical 998702
Olympus BX 40 microscope Olympus
Operating forceps Sigma-Aldrich
Operating scissors Sigma-Aldrich
Optical scanner Canon Cano Scan 4200F Resolution 3200 x 6400 dpi
Petri dishes Sigma-Aldrich P5606
Purina Chow Purina 5001 Rodent laboratory chow given to rats, mice and hamster is a life-cycle nutrition that has been used in biomedical research for over 5 decades. Provided to rats ad libitum in this experiment.
Rat cages Techniplast 2000P Conventional housing for rodents. Cages were used for housing rats throughout the experiment
Scalpel blades #11 Sigma-Aldrich S2771
Software
Adobe Photoshop CS2 for Windows Adobe
ImageJ 1.37v NIH The source code is freely available. The author, Wayne Rasband (wayne@codon.nih.gov), is at the Research Services Branch, National Institute of Mental Health, Bethesda, Maryland, USA
Office 365 ProPlus Microsoft Microsoft Office Excel
Windows 10 Microsoft
Reagents
2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride Sigma-Aldrich 298-96-4
50% trichloroacetic acid Sigma-Aldrich 76-03-9
Ethanol 96 % Romical Flammable liquid
Evans blue 2% Sigma-Aldrich 314-13-6
Isoflurane, USP 100% Piramamal Critical Care, Inc NDC 66794-017

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Cite This Article
Frank, D., Gruenbaum, B. F., Grinshpun, J., Melamed, I., Severynovska, O., Kuts, R., Semyonov, M., Brotfain, E., Zlotnik, A., Boyko, M. Measuring Post-Stroke Cerebral Edema, Infarct Zone and Blood-Brain Barrier Breakdown in a Single Set of Rodent Brain Samples. J. Vis. Exp. (164), e61309, doi:10.3791/61309 (2020).

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