Misurazione dell'edema cerebrale post-ictus, della zona infarct e della rottura della barriera ematica-encefalica in un singolo set di campioni cerebrali dei roditori
Summary
Questo protocollo descrive una nuova tecnica di misurazione dei tre parametri più importanti della lesione cerebrale ischemica sullo stesso set di campioni cerebrali di roditori. L’uso di un solo campione cerebrale è altamente vantaggioso in termini di costi etici ed economici.
Abstract
Una delle cause più comuni di morbilità e mortalità in tutto il mondo è l’ictus ischemico. Storicamente, un modello animale utilizzato per stimolare l’ictus ischemico coinvolge l’occlusione dell’arteria cerebrale media (MCAO). Zona infarct, edema cerebrale e rottura della barriera ematico-encefalica (BBB) sono misurati come parametri che riflettono l’entità della lesione cerebrale dopo MCAO. Una limitazione significativa a questo metodo è che queste misurazioni sono normalmente ottenute in diversi campioni di cervello di ratto, portando a oneri etici e finanziari dovuti al gran numero di ratti che devono essere eutanasiati per una dimensione del campione appropriata. Qui presentiamo un metodo per valutare con precisione le lesioni cerebrali dopo MCAO misurando la zona infarct, l’edema cerebrale e la permeabilità BBB nello stesso set di cervelli di ratto. Questa nuova tecnica fornisce un modo più efficiente per valutare la fisiopatologia dell’ictus.
Introduction
Una delle cause più comuni di morbilità e mortalità in tutto il mondo è l’ictus. A livello globale, l’ictus ischemico rappresenta il 68% di tutti i casi di ictus, mentre negli Stati Uniti l’ictus ischemico rappresenta l’87% dei casidi ictus 1,2. Si stima che l’onere economico dell’ictus raggiunga i 34 miliardi di dollari negli StatiUniti 2 e 45 miliardi di euro nell’Unione europea3. I modelli animali di ictus sono necessari per studiarne la fisiopatologia, sviluppare nuovi metodi di valutazione e proporre nuove opzioni terapeutiche4.
L’ictus ischemico si verifica con occlusione di una grande arteria cerebrale, di solito l’arteria cerebrale centrale o uno dei suoi rami5. Così, i modelli di ictus ischemico hanno storicamente coinvolto l’occlusione dell’arteria cerebrale media (MCAO)6,7,8,9,10,11,12. Dopo MCAO, lesione neurologica è più comunemente valutata misurando la zona infar bene (IZ) utilizzando un metodo di colorazione 2,3,5-tripfeniltetrazolo (TTC)13, edema cerebrale (BE) utilizzando essiccazione o calcolo dei volumi emisferici14,15,16e permeabilità alla barriera epatica (BBB) con una tecnica di spettrometria che utilizza la colorazione blu Evans17,18,19.
Il tradizionale metodo MCAO utilizza insiemi separati di cervelli per ciascuna delle tre misurazioni cerebrali. Per un campione di grandi dimensioni, ciò si traduce in un numero significativo di animali eutanasiati, con considerazioni etiche e finanziarie aggiuntive. Un metodo alternativo per alleviare questi costi comporterebbe misurazioni di tutti e tre i parametri in un unico insieme di cervelli di roditori post-MCAO.
Precedenti tentativi sono stati fatti per misurare combinazioni di parametri nello stesso campione cerebrale. Metodi simultanei di colorazione immunofluorescente20 e altre analisi molecolari ebiochimiche 21 sono stati descritti dopo la colorazione TTC nello stesso campione cerebrale. In precedenza abbiamo calcolato i volumi dell’emisfero cerebrale per valutare l’edema cerebrale ed eseguito la colorazione TTC per calcolare la zona infarct nello stesso set cerebrale15.
Nel presente protocollo, presentiamo una tecnica MCAO modificata che misura le lesioni cerebrali ischemiche attraverso la determinazione della permeabilità IZ, BE e BBB nello stesso set di cervelli di roditori. IZ è misurato dalla colorazione TTC, BE è determinato calcolando il volume emisferico e la permeabilità BBB è ottenuta con metodi di spettrometria19. In questo protocollo, abbiamo utilizzato un modello MCAO modificato, basato sull’inserimento diretto e la fissazione del catetere monofilamento nell’arteria carotide interna (ICA) e sull’ulteriore blocco del flusso sanguigno verso l’arteria cerebrale media (MCA)22. Questo metodo modificato mostra una diminuzione del tasso di mortalità e morbilità rispetto al metodo tradizionale MCAO16,22.
Questo nuovo approccio fornisce un modello finanziario ed etico per misurare le lesioni neurologiche dopo l’MCAO. Questa valutazione dei principali parametri della lesione cerebrale ischemica aiuterà a indagare in modo completo la sua fisiopatologia.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’obiettivo principale del presente protocollo era quello di dimostrare misurazioni coerenti di tre parametri principali della lesione ischemica: permeabilità IZ, BE e BBB. Studi precedenti in questo campo hanno dimostrato la possibilità di eseguire uno o due di questi parametri insieme nello stesso campione. Oltre alla riduzione dei costi offerta da questo metodo in tre parti, fornisce anche un modello bioetico più desiderabile che limita il numero di animali che devono essere utilizzati e successivamente eutanasiati…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Maryna Kuscheriava, Maksym Kryvonosov, Daryna Yakumenko ed Evgenia Goncharyk del Dipartimento di Fisiologia, Facoltà di Biologia, Ecologia e Medicina, Oles Honchar, Università Dnipro, Dnipro, Ucraina per il loro sostegno e contributi utili alle nostre discussioni. I dati ottenuti fanno parte della tesi di dottorato di Ruslan Kuts.
Materials
| 2 mL Syringe | Braun | 4606027V | |
| 2% chlorhexidine in 70% alcohol solution | Sigma-Aldrich | 500 cc | Provides general antisepsis of the skin in the operatory field |
| 27 G Needle with Syringe | Braun | 305620 | |
| 3-0 Silk sutures | Henry Schein | 1007842 | |
| 4-0 Nylon suture | 4-00 | ||
| Brain & Tissue Matrices | Sigma-Aldrich | 15013 | |
| Cannula Venflon 22 G | KD-FIX | 183603985447 | |
| Centrifuge Sigma 2-16P | Sigma-Aldrich | Sigma 2-16P | |
| Compact Analytical Balances | Sigma-Aldrich | HR-AZ/HR-A | |
| Digital weighing scale | Sigma-Aldrich | Rs 4,000 | |
| Dissecting scissors | Sigma-Aldrich | Z265969 | |
| Eppendorf pipette | Sigma-Aldrich | Z683884 | |
| Eppendorf tube | Sigma-Aldrich | EP0030119460 | |
| Fluorescence detector | Tecan, Männedorf Switzerland | Model: Infinite 200 PRO multimode reader | Optional. |
| Fluorescence detector | Molecular Devices LLC | VWR cat. # 10822 512 SpectraMax Paradigm Multi Mode Microplate Reader Base Instrument | Optional. |
| Gauze sponges | Fisher | 22-362-178 | |
| Heater with thermometer | Heatingpad-1 | Model: HEATINGPAD-1/2 | |
| Hemostatic microclips | Sigma-Aldrich | ||
| Horizon-XL | Mennen Medical Ltd | ||
| Infusion cuff | ABN | IC-500 | |
| Micro forceps | Sigma-Aldrich | ||
| Micro scissors | Sigma-Aldrich | ||
| Multiset | Teva Medical | 998702 | |
| Olympus BX 40 microscope | Olympus | ||
| Operating forceps | Sigma-Aldrich | ||
| Operating scissors | Sigma-Aldrich | ||
| Optical scanner | Canon | Cano Scan 4200F | Resolution 3200 x 6400 dpi |
| Petri dishes | Sigma-Aldrich | P5606 | |
| Purina Chow | Purina | 5001 | Rodent laboratory chow given to rats, mice and hamster is a life-cycle nutrition that has been used in biomedical research for over 5 decades. Provided to rats ad libitum in this experiment. |
| Rat cages | Techniplast | 2000P | Conventional housing for rodents. Cages were used for housing rats throughout the experiment |
| Scalpel blades #11 | Sigma-Aldrich | S2771 | |
| Software | |||
| Adobe Photoshop CS2 for Windows | Adobe | ||
| ImageJ 1.37v | NIH | The source code is freely available. The author, Wayne Rasband (wayne@codon.nih.gov), is at the Research Services Branch, National Institute of Mental Health, Bethesda, Maryland, USA | |
| Office 365 ProPlus | Microsoft | – | Microsoft Office Excel |
| Windows 10 | Microsoft | ||
| Reagents | |||
| 2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride | Sigma-Aldrich | 298-96-4 | |
| 50% trichloroacetic acid | Sigma-Aldrich | 76-03-9 | |
| Ethanol 96 % | Romical | Flammable liquid | |
| Evans blue 2% | Sigma-Aldrich | 314-13-6 | |
| Isoflurane, USP 100% | Piramamal Critical Care, Inc | NDC 66794-017 |
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