JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Nederlands

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neuroscience

Het meten van post-beroerte cerebraal oedeem, infarctzone en bloed-hersenbarrière-afbraak in een enkele set knaagdierhersenmonsters

Published: October 23, 2020
doi:
10.3791/61309
, , , , , , , , ,
1Department of Anesthesiology and Critical Care, Soroka Medical Center,Ben-Gurion University of the Negev, 2Department of Anesthesiology,Yale University School of Medicine, 3Department of Neurosurgery, Soroka University Medical Center and the Faculty of Health Sciences,Ben-Gurion University of the Negev, 4Department of Physiology, Faculty of Biology, Ecology and Medicine,Dnepropetrovsk State University

Summary

Dit protocol beschrijft een nieuwe techniek om de drie belangrijkste parameters van ischemisch hersenletsel te meten op dezelfde set knaagdierhersenmonsters. Het gebruik van slechts één hersenmonster is zeer voordelig in termen van ethische en economische kosten.

Abstract

Een van de meest voorkomende oorzaken van morbiditeit en mortaliteit wereldwijd is ischemische beroerte. Historisch gezien omvat een diermodel dat wordt gebruikt om ischemische beroerte te stimuleren midden-cerebrale slagader occlusie (MCAO). Infarctzone, hersenoedeem en afbraak van de bloed-hersenbarrière (BBB) worden gemeten als parameters die de omvang van hersenletsel na MCAO weerspiegelen. Een belangrijke beperking van deze methode is dat deze metingen normaal gesproken worden verkregen in verschillende monsters van rattenhersenen, wat leidt tot ethische en financiële lasten vanwege het grote aantal ratten dat moet worden geëuthanaseerd voor een geschikte steekproefgrootte. Hier presenteren we een methode om hersenletsel na MCAO nauwkeurig te beoordelen door infarctzone, hersenoedeem en BBB-permeabiliteit in dezelfde set rattenhersenen te meten. Deze nieuwe techniek biedt een efficiëntere manier om de pathofysiologie van beroerte te evalueren.

Introduction

Een van de meest voorkomende oorzaken van morbiditeit en mortaliteit wereldwijd is beroerte. Wereldwijd vertegenwoordigt ischemische beroerte 68% van alle beroertegevallen, terwijl in de Verenigde Staten ischemische beroerte 87% van de beroertegevallenvertegenwoordigt 1,2. Geschat wordt dat de economische last van beroerte in de Verenigde Staten2 en 45 miljard EUR in de Europese Unie3bedraagt . Diermodellen van beroerte zijn nodig om de pathofysiologie te bestuderen, nieuwe methoden voor evaluatie te ontwikkelen en nieuwe therapeutische opties voor te stellen4.

Ischemische beroerte treedt op met occlusie van een belangrijke hersenslagader, meestal de middelste hersenslagader of een van de takken5. Zo hebben modellen van ischemische beroerte van oudsher betrekking gehad op midden-cerebrale slagader occlusie (MCAO)6,7,8,9,10,11,12. In navolging van MCAO, neurologisch letsel wordt meestal beoordeeld door infarctzone (IZ) te meten met behulp van een 2,3,5-triphenyltetrazoliumchloride (TTC) kleuringsmethode13, hersenoedeem (BE) met behulp van of het berekenen van hemisferische volumes14,15,16, en bloed hersenbarrière (BBB) permeabiliteit door middel van een spectrometrie techniek met behulp van Evans blauwe kleuring17,18,19.

De traditionele MCAO-methode maakt gebruik van afzonderlijke sets hersenen voor elk van de drie hersenmetingen. Voor een grote steekproefgrootte resulteert dit in een aanzienlijk aantal geëuthanaseerde dieren, met extra ethische en financiële overwegingen. Een alternatieve methode om deze kosten te verlichten zou metingen van alle drie parameters in één set post-MCAO knaagdierhersenen omvatten.

Eerdere pogingen zijn gedaan om combinaties van parameters in hetzelfde hersenmonster te meten. Gelijktijdige immunofluorescente kleuringsmethoden20 evenals andere moleculaire en biochemische analyses21 zijn beschreven na TTC-kleuring in hetzelfde hersenmonster. We hebben eerder de volumes van de hersenhelft berekend om hersenoedeem te beoordelen en TTC-vlekken uitgevoerd om de infarctzone in dezelfde hersenset15te berekenen.

In dit protocol presenteren we een aangepaste MCAO-techniek die ischemisch hersenletsel meet door de permeabiliteit van IZ, BE en BBB in dezelfde set knaagdierhersenen te bepalen. IZ wordt gemeten door TTC-kleuring, BE wordt bepaald door het hemisferische volume te berekenen en BBB-permeabiliteit wordt verkregen door spectrometriemethoden19. In dit protocol gebruikten we een aangepast MCAO-model, gebaseerd op directe invoeging en fixatie van de monofilamentkatheter in de interne halsslagader (ICA) en verdere blokkering van de bloedtoevoer naar de middelste hersenslagader (MCA)22. Deze gewijzigde methode vertoont een verlaagd sterftecijfer en morbiditeit in vergelijking met de traditionele MCAO-methode16,22.

Deze nieuwe aanpak biedt een financieel verantwoord en ethisch model voor het meten van neurologisch letsel na MCAO. Deze beoordeling van de belangrijkste parameters van ischemisch hersenletsel zal helpen om de pathofysiologie uitgebreid te onderzoeken.

Protocol

De volgende procedures werden uitgevoerd overeenkomstig de aanbevelingen van de Verklaring van Helsinki en Tokio en de richtsnoeren voor het gebruik van proefdieren van de Europese Gemeenschap. De experimenten werden ook goedgekeurd door de Animal Care Committee van de Ben-Gurion University of the Negev. 1. Ratten voorbereiden op de experimentele procedure Selecteer volwassen mannelijke Sprague-Dawley ratten zonder openlijke pathologie, elk met een gewicht tussen 300 en 350 g. …

Representative Results

Infarctzonemeting Een onafhankelijke t-test gaf aan dat 19 ratten die permanente MCAO ondergingen een significante toename van het infarctvolume van de hersenen vertoonden in vergelijking met de 16 schijnratten (MCAO = 7,49% ± 3,57 vs. Sham = 0,31% ± 1,9, t(28,49) = 7,56, p < 0,01 (zie figuur 2A)). De gegevens worden uitgedrukt als een gemiddeld percentage van de contralaterale hemisfeer ± SD. <stro…

Discussion

Het belangrijkste doel van dit protocol was om consistente metingen van drie belangrijke parameters van ischemische schade aan te tonen: IZ, BE en BBB permeabiliteit. Eerdere studies op dit gebied hebben de mogelijkheid aangetoond om een of twee van deze parameters samen in dezelfde steekproef uit te voeren. Naast de kostenreductie die deze driedelige methode biedt, biedt het ook een wenselijker bio-ettisch model dat het aantal dieren beperkt dat moet worden geopereerd en vervolgens geëuthanaseerd. Zoals in alle histolo…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We danken Maryna Kuscheriava, Maksym Kryvonosov, Daryna Yakumenko en Evgenia Goncharyk van de afdeling Fysiologie, Faculteit Biologie, Ecologie en Geneeskunde, Oles Honchar, Dnipro University, Dnipro, Oekraïne voor hun steun en nuttige bijdragen aan onze discussies. De verkregen gegevens maken deel uit van het proefschrift van Ruslan Kuts.

Materials

2 mL Syringe Braun 4606027V
2% chlorhexidine in 70% alcohol solution Sigma-Aldrich 500 cc Provides general antisepsis of the skin in the operatory field
27 G Needle with Syringe Braun 305620
3-0 Silk sutures Henry Schein 1007842
4-0 Nylon suture 4-00
Brain & Tissue Matrices Sigma-Aldrich 15013
Cannula Venflon 22 G KD-FIX 183603985447
Centrifuge Sigma 2-16P Sigma-Aldrich Sigma 2-16P
Compact Analytical Balances Sigma-Aldrich HR-AZ/HR-A
Digital weighing scale Sigma-Aldrich Rs 4,000
Dissecting scissors Sigma-Aldrich Z265969
Eppendorf pipette Sigma-Aldrich Z683884
Eppendorf tube Sigma-Aldrich EP0030119460
Fluorescence detector Tecan, Männedorf Switzerland Model: Infinite 200 PRO multimode reader Optional.
Fluorescence detector Molecular Devices LLC VWR cat. # 10822 512 SpectraMax Paradigm Multi Mode Microplate Reader Base Instrument Optional.
Gauze sponges Fisher 22-362-178
Heater with thermometer Heatingpad-1 Model: HEATINGPAD-1/2
Hemostatic microclips Sigma-Aldrich
Horizon-XL Mennen Medical Ltd
Infusion cuff ABN IC-500
Micro forceps Sigma-Aldrich
Micro scissors Sigma-Aldrich
Multiset Teva Medical 998702
Olympus BX 40 microscope Olympus
Operating forceps Sigma-Aldrich
Operating scissors Sigma-Aldrich
Optical scanner Canon Cano Scan 4200F Resolution 3200 x 6400 dpi
Petri dishes Sigma-Aldrich P5606
Purina Chow Purina 5001 Rodent laboratory chow given to rats, mice and hamster is a life-cycle nutrition that has been used in biomedical research for over 5 decades. Provided to rats ad libitum in this experiment.
Rat cages Techniplast 2000P Conventional housing for rodents. Cages were used for housing rats throughout the experiment
Scalpel blades #11 Sigma-Aldrich S2771
Software
Adobe Photoshop CS2 for Windows Adobe
ImageJ 1.37v NIH The source code is freely available. The author, Wayne Rasband (wayne@codon.nih.gov), is at the Research Services Branch, National Institute of Mental Health, Bethesda, Maryland, USA
Office 365 ProPlus Microsoft – Microsoft Office Excel
Windows 10 Microsoft
Reagents
2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride Sigma-Aldrich 298-96-4
50% trichloroacetic acid Sigma-Aldrich 76-03-9
Ethanol 96 % Romical Flammable liquid
Evans blue 2% Sigma-Aldrich 314-13-6
Isoflurane, USP 100% Piramamal Critical Care, Inc NDC 66794-017
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Krishnamurthi, R. V., et al. Global and regional burden of first-ever ischaemic and haemorrhagic stroke during 1990-2010: findings from the Global Burden of Disease Study 2010. Lancet Global Health. 1, 259-281 (2013).
  2. Benjamin, E. J., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2017 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 135, 146 (2017).
  3. Wilkins, E., et al. . European cardiovascular disease statistics 2017. , (2017).
  4. Fluri, F., Schuhmann, M. K., Kleinschnitz, C. Animal models of ischemic stroke and their application in clinical research. Drug Design, Development and Therapy. 9, 3445-3454 (2015).
  5. Lloyd-Jones, D., et al. Heart disease and stroke statistics–2009 update: a report from the American Heart Association Statistics Committee and Stroke Statistics Subcommittee. Circulation. 119, 480-486 (2009).
  6. Shigeno, T., McCulloch, J., Graham, D. I., Mendelow, A. D., Teasdale, G. M. Pure cortical ischemia versus striatal ischemia. Circulatory, metabolic, and neuropathologic consequences. Surgical Neurology. 24, 47-51 (1985).
  7. Albanese, V., Tommasino, C., Spadaro, A., Tomasello, F. A transbasisphenoidal approach for selective occlusion of the middle cerebral artery in rats. Experientia. 36, 1302-1304 (1980).
  8. Hudgins, W. R., Garcia, J. H. Transorbital approach to the middle cerebral artery of the squirrel monkey: a technique for experimental cerebral infarction applicable to ultrastructural studies. Stroke. 1, 107-111 (1970).
  9. Waltz, A. G., Sundt, T. M., Owen, C. A. Effect of middle cerebral artery occlusion on cortical blood flow in animals. Neurology. 16, 1185-1190 (1966).
  10. Tamura, A., Graham, D. I., McCulloch, J., Teasdale, G. M. Focal cerebral ischaemia in the rat: 1. Description of technique and early neuropathological consequences following middle cerebral artery occlusion. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 1, 53-60 (1981).
  11. Aspey, B. S., Cohen, S., Patel, Y., Terruli, M., Harrison, M. J. Middle cerebral artery occlusion in the rat: consistent protocol for a model of stroke. Neuropathology and Applied Neurobiology. 24, 487-497 (1998).
  12. Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20, 84-91 (1989).
  13. O’Brien, M. D., Jordan, M. M., Waltz, A. G. Ischemic cerebral edema and the blood-brain barrier. Distributions of pertechnetate, albumin, sodium, and antipyrine in brains of cats after occlusion of the middle cerebral artery. Archives of Neurology. 30, 461-465 (1974).
  14. Chen, C. H., Toung, T. J., Sapirstein, A., Bhardwaj, A. Effect of duration of osmotherapy on blood-brain barrier disruption and regional cerebral edema after experimental stroke. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 26, 951-958 (2006).
  15. Boyko, M., et al. Establishment of Novel Technical Methods for Evaluating Brain Edema and Lesion Volume in Stroked Rats: a Standardization of Measurement Procedures. Brain Research. , (2019).
  16. Boyko, M., et al. An experimental model of focal ischemia using an internal carotid artery approach. Journal of Neuroscience Methods. 193, 246-253 (2010).
  17. Sifat, A. E., Vaidya, B., Abbruscato, T. J. Blood-Brain Barrier Protection as a Therapeutic Strategy for Acute Ischemic Stroke. AAPS Journal. 19, 957-972 (2017).
  18. Jiang, X., et al. Blood-brain barrier dysfunction and recovery after ischemic stroke. Progress in Neurobiology. 163-164, 144-171 (2018).
  19. Belayev, L., Busto, R., Zhao, W., Ginsberg, M. D. Quantitative evaluation of blood-brain barrier permeability following middle cerebral artery occlusion in rats. Brain Research. 739, 88-96 (1996).
  20. Li, L., Yu, Q., Liang, W. Use of 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride-stained brain tissues for immunofluorescence analyses after focal cerebral ischemia in rats. Pathology – Research and Practice. 214, 174-179 (2018).
  21. Kramer, M., et al. TTC staining of damaged brain areas after MCA occlusion in the rat does not constrict quantitative gene and protein analyses. Journal of Neuroscience Methods. 187, 84-89 (2010).
  22. Kuts, R., et al. A middle cerebral artery occlusion technique for inducing post-stroke depression in rats. Journal of Visualized Experiments. , e58875 (2019).
  23. Kuts, R., et al. A Novel Method for Assessing Cerebral Edema, Infarcted Zone and Blood-Brain Barrier Breakdown in a Single Post-stroke Rodent Brain. Frontiers in Neuroscience. 13, 1105 (2019).
  24. McGarry, B. L., Jokivarsi, K. T., Knight, M. J., Grohn, O. H. J., Kauppinen, R. A. A Magnetic Resonance Imaging Protocol for Stroke Onset Time Estimation in Permanent Cerebral Ischemia. Journal of Visualized Experiments. , e55277 (2017).
  25. Uluc, K., Miranpuri, A., Kujoth, G. C., Akture, E., Baskaya, M. K. Focal cerebral ischemia model by endovascular suture occlusion of the middle cerebral artery in the rat. Journal of Visualized Experiments. , e1978 (2011).
  26. Boyko, M., et al. The effect of blood glutamate scavengers oxaloacetate and pyruvate on neurological outcome in a rat model of subarachnoid hemorrhage. Neurotherapeutics. 9, 649-657 (2012).
  27. Kuts, R., et al. A Middle Cerebral Artery Occlusion Technique for Inducing Post-stroke Depression in Rats. Journal of Visualized Experiments. , e58875 (2019).
  28. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. , e3564 (2012).
  29. Poinsatte, K., et al. Quantification of neurovascular protection following repetitive hypoxic preconditioning and transient middle cerebral artery occlusion in mice. Journal of Visualized Experiments. , e52675 (2015).
  30. . ImageJ, U. S. National Institutes of Health Available from: https://imagej.nih.gov/ij (2018)
  31. Boyko, M., et al. Pyruvate’s blood glutamate scavenging activity contributes to the spectrum of its neuroprotective mechanisms in a rat model of stroke. European Journal of Neuroscience. 34, 1432-1441 (2011).
  32. Collins, T. J. ImageJ for microscopy. Biotechniques. 43, 25-30 (2007).
  33. . ImageJ, U. S. National Institutes of Health Available from: https://imagej.nih.gov/ij (1997)
  34. Kaplan, B., et al. Temporal thresholds for neocortical infarction in rats subjected to reversible focal cerebral ischemia. Stroke. 22, 1032-1039 (1991).
  35. Kumai, Y., et al. Postischemic gene transfer of soluble Flt-1 protects against brain ischemia with marked attenuation of blood-brain barrier permeability. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 27, 1152-1160 (2007).
  36. Schuleri, K. H., et al. Characterization of peri-infarct zone heterogeneity by contrast-enhanced multidetector computed tomography: a comparison with magnetic resonance imaging. Journal of the American College of Cardiology. 53, 1699-1707 (2009).
  37. Singh, A., Kukreti, R., Saso, L., Kukreti, S. Oxidative Stress: A Key Modulator in Neurodegenerative Diseases. Molecules. 24, (2019).
  38. Di Napoli, M. Caplan’s Stroke: A Clinical Approach. Journal of the American Medical Association. 302, 2600-2601 (2009).
  39. Deb, P., Sharma, S., Hassan, K. M. Pathophysiologic mechanisms of acute ischemic stroke: An overview with emphasis on therapeutic significance beyond thrombolysis. Pathophysiology. 17, 197-218 (2010).
  40. Simard, J. M., Kent, T. A., Chen, M., Tarasov, K. V., Gerzanich, V. Brain oedema in focal ischaemia: molecular pathophysiology and theoretical implications. Lancet Neurology. 6, 258-268 (2007).
  41. Klatzo, I. Pathophysiological aspects of brain edema. Acta Neuropathology. 72, 236-239 (1987).
  42. Yang, Y., Rosenberg, G. A. Blood-brain barrier breakdown in acute and chronic cerebrovascular disease. Stroke. 42, 3323-3328 (2011).
  43. Lin, T. N., He, Y. Y., Wu, G., Khan, M., Hsu, C. Y. Effect of brain edema on infarct volume in a focal cerebral ischemia model in rats. Stroke. 24, 117-121 (1993).
  44. Liu, C., et al. Increased blood-brain barrier permeability in contralateral hemisphere predicts worse outcome in acute ischemic stroke after reperfusion therapy. Journal of NeuroInterventional Surgery. 10, 937-941 (2018).
  45. Boyko, M., et al. Establishment of novel technical methods for evaluating brain edema and lesion volume in stroked rats: A standardization of measurement procedures. Brain Research. 1718, 12-21 (2019).

Tags

StrokeCerebral EdemaInfarct ZoneBlood-brain BarrierBBB PermeabilityMiddle Cerebral Artery OcclusionIschemic Brain InjuryTTC StainingImageJInfarct VolumeBrain EdemaTrichloroacetic AcidLuminescence Spectrophotometry

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Frank, D., Gruenbaum, B. F., Grinshpun, J., Melamed, I., Severynovska, O., Kuts, R., Semyonov, M., Brotfain, E., Zlotnik, A., Boyko, M. Measuring Post-Stroke Cerebral Edema, Infarct Zone and Blood-Brain Barrier Breakdown in a Single Set of Rodent Brain Samples. J. Vis. Exp. (164), e61309, doi:10.3791/61309 (2020).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image