Canlı Isı Stresli Drosophila Embriyolarında İntranükleer Akin Çubuklarının Görüntülenmesi
Summary
Bu protokolün amacı, Rhodamine konjuge globüler aksini Drosophila embriyolarına enjekte etmek ve ısı stresini takiben intranükleer aksin çubuk tertibatını görmektir.
Abstract
Bu protokolün amacı, ısı stresinden sonra canlı Drosophila melanogaster embriyolarında bir araya gelen intranükleer akin çubuklarını görselleştirmektir. Aktiin çubukları, nörodejeneratif hastalık da dahil olmak üzere insan patolojilerine eşlik eden korunmuş, indüklenen Bir Aktün Stres Yanıtı’nın (ASR) ayırt edici özelliğidir. Daha önce, ASR’nin morfogenez başarısızlıklarına ve gelişmekte olan embriyoların canlılığının azalmasına katkıda bulunduğunu gösterdik. Bu protokol, görüntüleme, genetik ve biyokimyaya son derece uygun bir model sisteminde aktin çubuk montajının ve ASR’nin altında bulunan mekanizmaların sürekli incelenmesini sağlar. Embriyolar toplanır ve enjeksiyona hazırlamak için bir kapak kapağına monte edilir. Rhodamine konjuge globüler aktilin (G-actinRed)seyreltilir ve bir mikroneedle yüklenir. Her embriyonun ortasına tek bir enjeksiyon yapılır. Enjeksiyondan sonra embriyolar yüksek sıcaklıkta inkübe edilir ve intranükleer aksin çubukları daha sonra konfokal mikroskopi ile görselleştirilir. Aktüer çubuklarında fotobleaching (FRAP) deneyleri yapıldıktan sonra floresan iyileşmesi yapılabilir; ve sitoplazmdaki diğer aktin bakımından zengin yapılar da görüntülenebilir. G-actinRed’in endojen G-actin gibi polimerize olduğunu ve kendi başına normal embriyo gelişimine müdahale etmediğini görüyoruz. Bu protokolün bir sınırlaması, embriyonun ciddi yaralanmasını önlemek için enjeksiyon sırasında dikkatli olunması gerektiğidir. Bununla birlikte, pratikte, G-actinRed’i Drosophila embriyolarına enjekte etmek, aktivin çubuklarını görselleştirmenin hızlı ve güvenilir bir yoludur ve herhangi bir genotip sinekle veya hipoksi ve oksidatif stres de dahil olmak üzere diğer hücresel streslerin girmesiyle kolayca kullanılabilir.
Introduction
Bu protokol, indükleyici bir Actin Stres Yanıtı (ASR)1geçiren ısı stresli embriyolarda intranükleer akin çubuklarının montajını görselleştirmek için G-actinRed’in nasıl enjekte edildiğini açıklar. Bu protokolü, embriyolarda morfogenezin bozulmasına ve canlılığın azalmasına yol açan ASR çalışmalarına yardımcı olmak için geliştirdik ve yetişkin insan hücre tiplerinde böbrek yetmezliği2, kas miyopatileri3ve Alzheimer ve Huntington Hastalığı 4 ,5,6,7,8gibi patolojilerle ilişkilidir. Bu ASR, ısı şoku 9 , 10 ,11,oksidatif stres4,6,azaltılmış ATP sentezi12ve anormal Huntingtin veya β-amiloid oligomerizasyon 4 , 5 , 6 ,7,9,13,14,15,16dahil olmak üzere çok sayıda hücresel stres tarafından indüklenmiştir. ASR’nin ayırt edici özelliği, etkilenen hücrelerin sitoplazmasında veya çekirdeğinde anormal aktin çubuklarının montajıdır, bu da aktin etkileşime giren bir proteinin stres kaynaklı hiperaktivasyonu ile tahrik edilir, Cofilin 1,5,6,10. Ne yazık ki, ASR ile ilgili önemli bilgi boşlukları devam etmektedir. Örneğin, akin çubuklarının işlevi bilinmemektedir. Çubukların neden bazı hücre tiplerinin sitoplazmasında, ancak diğerlerinin çekirdeğinde oluştuğunu anlamıyoruz. ASR’nin strese giren hücreler veya embriyolar için koruyucu mu yoksa uyumsuz mu olduğu da açık değildir. Son olarak, Cofilin hiperaktivasyonu veya aktüer çubuk tertibatını temel alan ayrıntılı mekanizmaları hala bilmiyoruz. Bu nedenle, bu protokol, canlı meyve sineği embriyosunun son derece çekişli deneysel sisteminde akin çubuğu oluşumunu ve dinamiklerini görselleştirerek ASR’yi araştırmak için hızlı ve çok yönlü bir test sağlar.
G-actinRed’i canlı Drosophila embriyolarına mikroenja alma protokolü başlangıçta doku oluşturma olayları sırasında normal sitoplazmik aktin yapıların17 dinamiklerini incelemek için geliştirilmiştir. Bu çalışmalarda, G-actinRed enjeksiyonunun sitokinoz veya gastrülasyon dahil olmak üzere embriyodaki erken gelişim süreçlerini olumsuz etkilemediğini bulduk17,18. Daha sonra protokolü değiştirdik, embriyo işleme ve G-actinKırmızı enjeksiyonu, ASR1’dengeçen ısı stresli embriyolarda akin çubuklarının görüntülenmesine izin vermek için uyarladık. Embriyolarda aksini görselleştirmek için G-actinRed enjeksiyonu dışında başka yöntemler de kullanılabilir. Bu yöntemler, Utrophin-mCherry, Lifeact, F-tractin-GFP ve Moesin-GFP(19’daincelenmiştir) gibi aktivin bağlayıcı proteinlerin etki alanlarına veya aktivin bağlayıcı proteinlerin etki alanlarına etiketlenmiş floresan proteinleri (FPs) ifade etmeye dayanır. Bununla birlikte, bu FP problarını kullanmak dikkatli olmayı gerektirir, çünkü bazı aksin yapılarını stabilize edebilir veya bozabilirler, tüm akin yapılarını eşit olaraketiketlemezler 20ve akin-GFP durumunda, son derece fazla ifade edilir – sadece strese bağlı değil, aynı zamanda aksin konsantrasyonuna bağımlı olan çubuk tertibatının analizi içinsorunludur 1. Bu nedenle, G-actinRed sinek embriyolarında çubuk çalışmaları için tercih edilen probdur ve embriyonun büyüklüğü kolay enjeksiyonunu sağlar.
Bu protokolün iş akışı, Drosophila embriyolarına proteinler, nükleik asitler, ilaçlar ve floresan göstergeler enjekte etmek için kullanılan diğer köklü mikroenjeksiyon tekniklerine benzer21 , 22,23,24,25,26,27. Bununla birlikte, burada G-actinRed’in mikroenjeksiyonunun ardından embriyolar ASR ve intranükleer aksin çubuk tertibatını teşvik etmek için hafif ısı stresine maruz kalırlar. Sineklere erişimi olan laboratuvarlar ve enjeksiyon teçhizatı için, bu yöntem, farklı stresler tarafından indüksiyonu veya farklı genetik geçmişlerde modülasyon da dahil olmak üzere ASR ile ilgili belirli çalışma hatları için kolayca uygulanabilir ve uyarlanabilir olmalıdır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu yöntemin önemi, ASR ve eşlik eden akin çubuk montajı ile ilgili yeni araştırmalara olanak sağlamak için Drosophila embriyoları21,22,23,24,25,26,27’de iyi kurulmuş mikroenjeksiyon protokolünü kullanmasıdır. G-actinRed’i canlı embriyolara enjekte etmenin …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, Sokac laboratuvarında bu tekniğin öncülükine yardımcı olan Liuliu Zheng ve Zenghui Xue’nun yanı sıra analize yardımcı olan Hasan Seede’nin çalışmalarını minnetle kabul ediyorlar. Bu çalışma nih (R01 GM115111) tarafından bir hibe ile finanse edilir.
Materials
| Adenosine triphosphate (ATP) | Millipore-Sigma | A23835G | Component of G buffer |
| Apple juice, Mott's, 64 fl oz | Mott's | 014800000344 | Component of apple juice plates |
| Bacto Agar | BD | 214010 | Component of apple juice plates |
| Bleach, PureBright Germicidal, 6.0% sodium hypochlorite | KIK International | 059647210020 | For dechorionating embryos |
| Calcium chloride | Millipore-Sigma | C1016500G | Component of G buffer |
| Cell strainer, 70 μm | Falcon | 352350 | For collecting dechorionated embryos |
| Confocal microscope, LSM 880 34-channel with Airyscan | Zeiss | 0000001994956 | For imaging intranuclear actin rods |
| Desiccant | Drierite | 24001 | For desiccating embryos |
| Dissecting microscope, Stemi 508 Stereoscope with 8:1 zoom | Zeiss | 4350649000000 | For arranging embryos on agar wedge |
| Dissecting needle, 5 in | Fisher Scientific | 08965A | For arranging embryos on agar wedge |
| Dithiothreitol (DTT) | Fisher Scientific | BP1725 | Component of G buffer |
| Double-sided Tape, Scotch Permanent, 0.5 in x 250 in | 3M | 021200010323 | For making embryo glue |
| Embryo collection cage | Genessee Scientific | 59100 | For housing adult flies and collecting embryos |
| Fine tip tweezers, Dumont Tweezer, Style 5 | Electron Microscopy Sciences | 72701D | For arranging embryos on agar wedge |
| Glass capillaries, Borosillicate glass, thin 1 mm x 0.75 mm | World Precision Instruments, Inc. | TW1004 | For microneedles |
| Halocarbon oil 27 | Millipore-Sigma | H8773100ML | For hydration of embryos |
| Heated stage incubator | Zeiss | 4118579020000, 4118609020000, 4118609010000 | For confocal imaging |
| Lab Tissue Wipers, KimWipes | Kimberly-Clark | 34155 | Lab tissue wipers |
| Light microscope, Invertoskop 40C Inverted Phase contrast microscope, refurbished | Zeiss | Discontinued | Injection microscope |
| Methyl-4-hydroxybenzoate | Millipore-Sigma | H36471KG | Component of apple juice plates |
| Microinjector, FemtoJet4x | Eppendorf | 5253000025 | Microinjector |
| Micro loader tips, epT.I.P.S. 20 μL | Eppendorf | 5242956003 | For loading microneedles |
| Micromanipulator and injection stage with x,y,z dials for needle adjustment | Bernard Instruments, Inc (Houston, TX) | Custom | For performing microinjections |
| Micropipette puller, Model P-97, Flaming/Brown | Sutter Instruments | P97 | For pulling capillary tubes to make microneedles |
| Microscope cover glass 24×50-1.5 | Fisher Scientific | 12544E | For mounting embryos |
| Microscope slides, Lilac Colorfrost, Precleaned, 25 x 75 x 1mm | Fisher Scientific | 22037081 | For mounting embryos for injection |
| n-Heptane | Fisher Scientific | H3601 | Component of embryo glue |
| Objective, 10x | Zeiss | Discontinued | 10x objective for injection microscope |
| Objective, C-Apochromat 40x/1,2 W Korr. FCS | Zeiss | 4217679971711 | 40x water objective for confocal |
| Objective, LD LCI Plan-Apochromat 25x/0.8 Imm Cor DIC M27 for oil, water, silicone oil or glycerine immersion (D=0-0.17mm) (WD=0.57mm at D=0.17mm) | Zeiss | 4208529871000 | 25x mixed immersion objective for confocal |
| Objective, Plan-Apocrhomat 63x/1.40 Oil DIC f/ELYRA | Zeiss | 4207829900799 | 63x oil objective for confocal |
| Paintbrush, Robert Simmons Expression E85 Pointed Round size 2 | Daler-Rowney | 038372016954 | For transferring embryos |
| Paper towels, Kleenex C-fold paper towels, white | Kimberly-Clark | 884266344845 | For blotting cell strainer |
| Pasteur pipette, 5 3/4 in | Fisher Scientific | 1367820A | For covering embryos with oil |
| Petri dish, glass, 100 x 20 mm | Corning | 3160102 | For humid incubation chamber |
| Petri dish, plastic, 60 x 15 mm | VWR | 25384092 | For apple juice plates |
| Pipette, Eppendorf Reference 0.5-10 μL | Eppendorf | 2231000604 | For loading the microneedle |
| Pipette tip, xTIP4 250 μL | Biotix | 63300006 | For adding embryo glue to coverslip |
| Razor blade | VWR | 55411050 | For cutting agar wedge, tape, pipette tips |
| Rhodamine-conjugated globular actin, human platelet (non-muscle; 4×10 μg) | Cytoskeleton, Inc. | APHR-A | G-actin^Red |
| Scintillation vial, 20 mL Glass borosillicate with polyethylene liner and urea caps | Fisher Scientific | 033377 | For making embryo glue |
| Screw top jar, 16 oz | Nalgene | 000194414195 | For desiccating embryos |
| Stage micrometer | Electron Microscopy Sciences | 602104PG | For calibrating volume of G-actin injection |
| Sucrose | Millipore-Sigma | 840971KG | Component of apple juice plates |
| Trizma base | Millipore-Sigma | T15031KG | Component of G buffer |
| Yeast, Lesaffre Yeast Corporation Yeast, Red Star Active Dry, 32 oz | Lesaffre Yeast Corporation | 117929157002 | Component of yeast paste |
References
- Figard, L., et al. Cofilin-mediated Actin Stress Response is maladaptive in heat-stressed embryos. Cell Reports. 26 (49), 3493-3501 (2019).
- Ashworth, S. L., et al. ADF/cofilin mediates actin cytoskeletal alterations in LLC-PK cells during ATP depletion. American Journal of Physiology Renal Physiology. 284 (4), 852-862 (2003).
- Vandebrouck, A., et al. In vitro analysis of rod composition and actin dynamics in inherited myopathies. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 69 (5), 429-441 (2010).
- Minamide, L. S., Striegl, A. M., Boyle, J. A., Meberg, P. J., Bamburg, J. R. Neurodegenerative stimuli induce persistent ADF/cofilin-actin rods that disrupt distal neurite function. Nature Cell Biology. 2 (9), 628-636 (2000).
- Bamburg, J. R., et al. ADF/Cofilin-actin rods in neurodegenerative diseases. Current Alzheimer Research. 7 (3), 241-250 (2010).
- Bamburg, J. R., Bernstein, B. W. Actin dynamics and cofilin-actin rods in alzheimer disease. Cytoskeleton. 73 (9), 477-497 (2016).
- Bernstein, B. W., Chen, H., Boyle, J. A., Bamburg, J. R. Formation of actin-ADF/cofilin rods transiently retards decline of mitochondrial potential and ATP in stressed neurons. AJP: Cell Physiology. 291 (5), 828-839 (2006).
- Munsie, L. N., Desmond, C. R., Truant, R. Cofilin nuclear-cytoplasmic shuttling affects cofilin-actin rod formation during stress. Journal of Cell Science. 125 (17), 3977-3988 (2012).
- Iida, K., Iida, H., Yahara, I. Heat shock induction of intranuclear actin rods in cultured mammalian cells. Experimental Cell Research. 165, 207-215 (1986).
- Ohta, Y., Nishida, E., Sakai, H., Miyamoto, E. Dephosphorylation of cofilin accompanies heat shock-induced nuclear accumulation of cofilin. Journal of Biological Chemistry. 264 (27), 16143-16148 (1989).
- Iida, K., Matsumoto, S., Yahara, I. The KKRKK sequence is involved in heat shock-induced nuclear translocation of the 18-kDa actin-binding protein, cofilin. Cell Structure and Function. 17 (1), 39-46 (1992).
- Minamide, L. S., et al. Isolation and characterization of cytoplasmic cofilin-actin rods. Journal of Biological Chemistry. 285 (8), 5450-5460 (2010).
- Masurovsky, E. B., Benitez, H. H., Kim, S. U., Murray, M. R. Origin, development, and nature of intranuclear rodlets and associated bodies in chicken sympathetic neurons. The Journal of Cell Biology. 44 (7), 172-191 (1970).
- Feldman, M. L., Peters, A. Intranuclear rods and sheets in rat cochlear nucleus. Journal of Neurocytology. 1 (2), 109-127 (1972).
- Nishida, E., et al. Cofilin is a component of intranuclear and cytoplasmic actin rods induced in cultured cells. Cell Biology. 84 (8), 5262-5266 (1987).
- Ono, S., Abe, H., Nagaoka, R., Obinata, T. Colocalization of ADF and cofilin in intranuclear actin rods of cultured muscle cells. Journal of Muscle Research and Cell Motility. 14 (2), 195-204 (1993).
- Xue, Z., Sokac, A. M. Back-to-back mechanisms drive actomyosin ring closure during Drosophila embryo cleavage. The Journal of Cell Biology. 215 (3), 335-344 (2016).
- Cao, J., Albertson, R., Riggs, B., Field, C. M., Sullivan, W. Nuf, a Rab11 effector, maintains cytokinetic furrow integrity by promoting local actin polymerization. Journal of Cell Biology. 182 (2), 301-313 (2008).
- Spracklen, A. J., Fagan, T. N., Lovander, K. E., Tootle, T. L. The pros and cons of common actin labeling tools for visualizing actin dynamics during Drosophila oogenesis. Developmental Biology. 393 (2), 209-226 (2014).
- Chen, Q., Nag, S., Pollard, T. D. Formins filter modified actin subunits during processive elongation. Journal of Structural Biology. 177 (1), 32-39 (2012).
- Iordanou, E., Chandran, R. R., Blackstone, N., Jiang, L. RNAi interference by dsRNA injection into Drosophila embryos. Journal of Visualized Experiments. (50), 2477 (2011).
- Juarez, M. T., Patterson, R. A., Li, W., McGinnis, W. Microinjection wound assay and in vivo localization of epidermal wound response reporters in Drosophila embryos. Journal of Visualized Experiments. 81, 50750 (2013).
- Carreira-Rosario, A., et al. Recombineering homologous recombination constructs in Drosophila. Journal of Visualized Experiments. (77), 50346 (2013).
- Brust-Mascher, I., Scholey, J. M. Microinjection techniques for studying mitosis in the Drosophila melanogaster syncytial embryo. Journal of Visualized Experiments. (31), 1382 (2009).
- Catrina, I. E., Bayer, L. V., Omar, O. S., Bratu, D. P. Visualizing and tracking endogenous mRNAs in live Drosophila melanogaster egg chambers. Journal of Visualized Experiments. (148), 58545 (2019).
- Wessel, A. D., Gumalla, M., Grosshans, J., Schmidt, C. F. The mechanical properties of early Drosophila embryos measured by high-speed video microrheology. Biophysical Journal. 108 (8), 1899-1907 (2015).
- Mollinari, C., González, A., Cid-Arregui, A., García-Carrancá, Microinjection and transgenesis. Microinjection and Transgenesis: Strategies and Protocols. , 587-603 (1998).
- Figard, L., Sokac, A. M. Imaging cell shape change in living Drosophila embryos. Journal of Visualized Experiments. (49), 2503 (2011).
- Oesterle, A. . Pipette Cookbook 2018: P-97 and P-1000 Micropipette Pullers. , (2018).
- Bownes, M. A photographic study of development in the living embryo of Drosophila melanogaster. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 33 (3), 789-801 (1975).
- Powsner, L. The effects of temperature on the durations of the developmental stages of Drosophila melanogaster. Physiological Zoology. 8 (4), 474-520 (1935).
- Hunter, M. V., Willoughby, P. M., Bruce, A. E. E., Fernandez-Gonzalez, R. Oxidative Stress Orchestrates Cell Polarity to Promote Embryonic Wound Healing. Developmental Cell. 47 (3), 377-387 (2018).
