Изображение Внутриядерных Actin Роды в Live Heat подчеркнул Drosophila эмбрионов

Этот протокол описывает, как вводить G-actin^Red, чтобы визуализировать сборку внутриядерных актин-стержней в термечных эмбрионах, которые проходят неопругиваемый actin Stress Response (ASR)¹. Мы разработали этот протокол, чтобы помочь исследованиям ASR, который в эмбрионах приводит к нарушению морфогенеза и снижению жизнеспособности, а у взрослых типов клеток человека связано с патологиями,^{включая почечную недостаточность 2,мышечные миопатии 3}, и болезнь Альцгеймера^{и болезнь Хантингтона 4,5,6,7,8}. Это ASR вызвано многочисленными клеточными напряжениями, в том^{числе тепловой шок 9,10,11},^{окислительный стресс 4,6}, снижение^{синтеза АТФ 12}, и ненормальные Хантингтин или β-амилоида^{олигомеризации 4,5,6,7,9,13,14,15,16}. Отличительной чертой ASR является сборка аноматических актиновых стержней либо в цитоплазме, либо в ядре пораженных клеток, что обусловлено вызванной стрессом гиперактивацией актин-взаимодействующих белков, cofilin^1,5,6,10. К сожалению, по-прежнему сохраняются пробелы в знаниях в отношении ASR. Например, функция актин-стержней неизвестна. Мы не понимаем, почему стержни образуются в цитоплазме некоторых типов клеток, но ядро других. Также не ясно, является ли ASR защитным или неадаптивным для клеток или эмбрионов, переживая стресс. Наконец, мы до сих пор не знаем подробных механизмов, лежащих в основе гиперактивации Cofilin или сборки актин стержня. Таким образом, этот протокол обеспечивает быстрый и универсальный анализ для зондирования ASR путем визуализации актин формирования стержня и динамики в высокоуроспособной экспериментальной системы эмбриона живой плодовой мухи.

Протокол микроинъекций G-actin^{Red в живые} эмбрионы дрозофилы был первоначально разработан для изучения динамики нормальных цитоплазмических актиновых^{структур 17 во} время построения тканей. В этих исследованиях мы обнаружили, что инъекция G-actin^Red не оказывает негативного влияния на ранние процессы развития эмбриона, включая цитокинез^{или гастрипуляцию 17,18}. Затем мы изменили протокол, адаптируя обработку эмбриона и G-actin^{Red инъекции,} чтобы изображение актин стержней в тепловой подчеркнул эмбрионов, проходящих ASR¹. Другие методы, кроме инъекции G-actin^Red, могут быть использованы для визуализации актина в эмбрионах. Эти методы опираются на выражение флуоресцентных белков (FPs) помечены актина или доменов актин связывания белков, таких как Утрофин-мчерри, Lifeact, F-tractin-GFP, и Moesin-GFP (рассмотрен^{в 19}). Однако, используя эти FP зонды требует осторожности, потому что они могут стабилизировать или нарушить некоторые актин структуры, не в равной степени^{маркировать все актин структуры 20}, а в случае актин-GFP, очень переэкспрессированы – проблематично для анализа стержня сборки, которая является не только стресс зависит, но и actin концентрации^{зависит 1}. Таким образом, G-actin^{Red является предпочтительным} зондом для исследования стержня в эмбрионах мух, а большой размер эмбриона позволяет его легко инъекцию.

Рабочий процесс этого протокола похож на другие устоявшиеся методы микроинъекции, которые были использованы для инъекций белков, нуклеиновых кислот, лекарств и флуоресцентных индикаторов в эмбрионы дрозофилы^{21,22,23,24,25,26,27}. Однако, после микроинъекции G-actin^Red здесь, эмбрионы подвергаются легкому тепловому стрессу, чтобы вызвать сборку ASR и внутриядерного актина стержня. Для лабораторий с доступом к мухам и инъекционной установке этот метод должен быть легко реализуемым и адаптируемым для конкретных линий исследования в отношении ASR, включая его индукцию различными стрессами или модуляцией в различных генетических фонов.