Imagens Intranuclear Actin Rods em Embriões de Drosophila estressados de calor vivo

Este protocolo descreve como injetar G-actin^Red para visualizar a montagem de hastes de actina intranuclear em embriões estressados pelo calor que estão passando por uma Resposta de Estresse Actina indutível (ASR)¹. Desenvolvemos este protocolo para auxiliar estudos do ASR, que em embriões leva à morfogênese interrompida e à viabilidade reduzida, e em tipos de células humanas adultas está associado a patologias incluindo insuficiência renal^2,miopatias musculares^3,e Alzheimer e Doença de Huntington^4,5,6,7,8. Este ASR é induzido por numerosos estresses celulares, incluindo choque térmico^9,10,11, estresse oxidativo^4,6, síntese ATP reduzida¹², e huntingtin anormal ou β-amilóide oligomerização^{4,5,6,7,9,13,14,15,16}. Uma marca registrada do ASR é a montagem de hastes de actina aberrantes no citoplasma ou núcleo das células afetadas, que é impulsionada pela hiperativação induzida pelo estresse de uma proteína interativa de actina, Cofilin^1,5,6,10. Infelizmente, permanecem as principais lacunas de conhecimento em relação ao ASR. Por exemplo, a função das hastes de actin não é conhecida. Não entendemos por que as hastes se formam no citoplasma de alguns tipos de células, mas o núcleo de outros. Também não está claro se o ASR é protetor ou mal adaptável para células ou embriões submetidos a estresse. Finalmente, ainda não sabemos os mecanismos detalhados subjacentes à hiperativação de Cofilin ou ao conjunto de hastes actin. Assim, este protocolo fornece um ensaio rápido e versátil para sondar o ASR visualizando a formação e dinâmica da haste actin no sistema experimental altamente tratável do embrião de mosca de fruta viva.

O protocolo para microinjetar G-actin^Red em embriões Drosophila vivos foi inicialmente desenvolvido para estudar a dinâmica das estruturas normais de actina citoplasmática¹⁷ durante eventos de construção de tecidos. Nesses estudos, descobrimos que a injeção^vermelha G-actin não afetou negativamente os processos de desenvolvimento precoce no embrião, incluindo citocina ou gastraculação^17,18. Em seguida, modificamos o protocolo, adaptando o manuseio de embriões e a injeção^vermelha G-actin para permitir a imagem de hastes de actina em embriões estressados pelo calor submetidos ao ASR¹. Outros métodos além da injeção de G-actin^Red podem ser usados para visualizar actina em embriões. Esses métodos dependem da expressão de proteínas fluorescentes (FPs) marcadas para atuar ou para domínios de proteínas de ligação de actina, como Utrophin-mCherry, Lifeact, F-tractin-GFP e Moesin-GFP (revisada em^19). No entanto, o uso dessas sondas FP requer cautela, pois podem estabilizar ou interromper algumas estruturas de actina, não rotular igualmente todas as estruturas actin²⁰, e no caso de actin-GFP, são altamente superexpressas – problemáticas para a análise da montagem de haste que não só é dependente do estresse, mas também atua na concentração dependente¹. Assim, g-actin^red é a sonda preferida para estudos de vara em embriões de mosca, e o grande tamanho do embrião permite sua fácil injeção.

O fluxo de trabalho deste protocolo é semelhante a outras técnicas de microinjeção bem estabelecidas que têm sido utilizadas para injetar proteínas, ácidos nucleicos, drogas e indicadores fluorescentes nos embriões de Drosophila ^{21,22,23,24,25,26,27}. No entanto, após a microinjeção do G-actin^Red aqui, os embriões são expostos a um leve estresse térmico para induzir o conjunto de hastes de actina ASR e intranuclear. Para laboratórios com acesso a moscas e uma plataforma de injeção, este método deve ser facilmente implementável e adaptável para linhas específicas de estudo em relação ao ASR, incluindo sua indução por diferentes estresses ou modulação em diferentes origens genéticas.