ライブ熱ストレスショ ウジョウバエ 胚における核内アクチンロッドのイメージング

このプロトコルは、誘導アクチンストレス応答(ASR)1を受けている熱ストレス胚における核内アクチン棒の集合体を可視化するためにG-アクチン^レッドを注入する方法を説明する。我々は、胚において形態形成の破壊および生存率の低下をもたらすASRの研究を支援するためにこのプロトコルを開発し、成人のヒト細胞型は腎不全^2、筋筋筋症^3、アルツハイマー病およびハンチントン病^{4、5、6、7、8}を含む病理に関連している。このASRは、ヒートショック^{9、10、11、}酸化ストレス^4、6、および異常ハンチンチンまたはβアミロイドオリゴマー化^{4、5、6、7、9、13、14、15、16}を含む多数の細胞ストレスによって誘発される。ASRの特徴は、アクチン相互作用タンパク質のストレス誘発過活性化によって駆動される細胞質または影響を受ける細胞の核のいずれかに異常なアクチン棒の組み立てであり、Cofilin^{1、5、6、10。}残念ながら、ASRに関する重要な知識のギャップは残っています。例えば、アクチン棒の機能は知られていない。私たちは、いくつかの細胞型の細胞質にロッドが形成される理由を理解していないが、他の人の核。また、ASRがストレスを受けている細胞や胚に対して保護的または不適応であるかどうかも明らかではない。最後に、コフィリンの過剰活性化やアクチンロッドアセンブリの根底にある詳細なメカニズムはまだ分かりません。したがって、このプロトコルは、生きたフルーツフライ胚の非常に難しい実験システムにおけるアクチンロッド形成およびダイナミクスを視覚化することによってASRを探査するための迅速かつ汎用性の高いアッセイを提供する。

生きているショウジョウバエ胚にG-アクチン^レッドをマイクロインジェクトするプロトコルは、組織構築イベント中に正常な細胞質アクチン構造¹⁷のダイナミクスを研究するために最初に開発された。これらの研究では、G-アクチン^レッド注射は、サイトカネシスまたは胃の^17、18を含む胚の初期の発達過程に悪影響を及ぼさないことを発見した。その後、プロトコルを変更し、ASR¹を受けている熱ストレス胚のアクチンロッドのイメージングを可能にするために、胚処理およびG-アクチン^レッド注入を適応させる。G-アクチン^赤注射以外の他の方法は、胚中のアクチンを視覚化するために使用することができる。これらの方法は、アクチンまたはウトロフィン-mCherry、ライフアクト、F-トラチンGFP、およびモージンGFPなどのアクチン結合タンパク質のドメインにタグ付けされた蛍光タンパク質(FP)を発現させることに依存している⁽¹⁹でレビュー)。しかし、これらのFPプローブを使用すると、いくつかのアクチン構造を安定または破壊する可能性があるため注意が必要であり、すべてのアクチン構造²⁰に等しくラベルを付け、アクチンGFPの場合は、応力依存だけでなくアクチン^{濃度依存性}のロッドアセンブリの分析に問題がある。したがって、G-アクチン^レッドは、フライ胚のロッド研究のための好ましいプローブであり、胚の大きなサイズは、その容易な注射を可能にする。

このプロトコルのワークフローは、ショウジョウバエ胚21、22、23、24、25、26、27にタンパク質、核酸、薬物、および蛍光指標を注入するために使用されてきた他の確立されたマイクロインジェクション技術に似ています。しかし、ここでのG-アクチン^レッドのマイクロインジェクションに続いて、胚は、ASRおよび核内アクチン棒集合体を誘導するために軽度の熱ストレスにさらされる。ハエや注入リグにアクセスできるラボでは、異なるストレスによる誘導や、異なる遺伝的背景での変調など、ASRに関する特定の研究ラインに対して、この方法を容易に実装し、適応可能にする必要があります。