Imaging Intranuclear Actin Rods in Live Heat Stressed Drosophila Embryos

Questo protocollo descrive come iniettare G-actin^{Red per} visualizzare l’assemblaggio di barre di actina intranucleare in embrioni stressati dal calore che stanno subendo un’induttibile risposta allo stress actina (ASR)¹. Abbiamo sviluppato questo protocollo per aiutare gli studi dell’ASR, che negli embrioni porta a morfogenesi interrotta e ridotta vitalità, e nei tipi di cellule umane adulte è associato a patologie tra cui insufficienza renale^2,miopatie^{muscolari 3}e morbo di Alzheimer e Huntington^4,5,6,7,8. Questa ASR è indotta da numerose sollecitazioni cellulari, tra cui shock^{termico 9,10,11,}stress ossidativo^4,6,ridotta sintesi ATP¹²e huntingtina anomala o oligomerizzazione β-amiloide^{4,5,6,7,9,13,14,15,16}. Un segno distintivo dell’ASR è l’assemblaggio di aste di actina aberrante nel citoplasma o nel nucleo delle cellule colpite, che è guidato dall’iperattivazione indotta dallo stress di una proteina che interagisce con l’actina, Cofilin^1,5,6,10. Sfortunatamente, permangono lacune chiave in materia di conoscenze per quanto riguarda l’ASR. Ad esempio, la funzione delle aste actin non è nota. Non capiamo perché le aste si formano nel citoplasma di alcuni tipi di cellule, ma il nucleo di altri. Né è chiaro se l’ASR sia protettivo o disadattiva per cellule o embrioni sottoposti a stress. Infine, non conosciamo ancora i meccanismi dettagliati alla base dell’iperattività cofilin o dell’assemblaggio dell’asta actina. Pertanto, questo protocollo fornisce un saggio rapido e versatile per sondare l’ASR visualizzando la formazione e la dinamica dell’asta di actina nel sistema sperimentale altamente trattabile dell’embrione di mosca della frutta vivente.

Il protocollo per microiniettare G-actin^Red in embrioni viventi di Drosophila è stato inizialmente sviluppato per studiare la dinamica delle normali strutture dell’actina citoplasmatica^{17 durante} gli eventi di costruzione dei tessuti. In questi studi, abbiamo scoperto che l’iniezione di G-actina^Red non ha influito negativamente sui primi processi di sviluppo nell’embrione, tra cui citocinesi o gastrulazione^17,18. Abbiamo quindi modificato il protocollo, adattando la manipolazione dell’embrione e l’iniezione G-actin^Red per consentire l’imaging di aste di actina in embrioni stressati dal calore sottoposti all’ASR¹. Altri metodi oltre all’iniezione di G-actin^Red possono essere utilizzati per visualizzare l’actina negli embrioni. Questi metodi si basano sull’esprimere proteine fluorescenti (FP) taggate ad actina o a domini di proteine che legano l’actina, come Utrophin-mCherry, Lifeact, F-tractin-GFP e Moesin-GFP (recensito in¹⁹). Tuttavia, l’uso di queste sonde FP richiede cautela perché possono stabilizzare o interrompere alcune strutture actina, non etichettano allo stesso modo tutte le strutture actin²⁰e, nel caso dell’actina-GFP, sono altamente sovraespresse – problematiche per l’analisi dell’assemblaggio dell’asta che non dipende solo dallo stress, ma agisce anche nella concentrazione^{dipendente 1}. Pertanto, G-actin^{Red è} la sonda preferita per gli studi sulle aste negli embrioni di mosca e le grandi dimensioni dell’embrione ne consentono la facile iniezione.

Il flusso di lavoro di questo protocollo è simile ad altre consolidate tecniche di microiniezione che sono state utilizzate per iniettare proteine, acidi nucleici, farmaci e indicatori fluorescenti negli embrioni di Drosophila ^{21,22,23,24,25,26,27}. Tuttavia, in seguito alla microiniezione di G-actin^Red qui, gli embrioni sono esposti a un leggero stress termico per indurre l’ASR e l’assemblaggio intranucleare dell’asta di actina. Per i laboratori con accesso alle mosche e un impianto di iniezione, questo metodo dovrebbe essere facilmente implementabile e adattabile per specifiche linee di studio per quanto riguarda l’ASR, compresa la sua induzione da diversi stress o modulazione in contesti genetici distinti.