הדמיה מוטות Actin תוך-גרעיניים בחום חי הדגישו עוברי דרוזופילה
Summary
המטרה של פרוטוקול זה היא להזריק רודמין מצומד אקטין כדורי לתוך עוברים Drosophila ואת התמונה הרכבה מוט actin תוך גרעיני בעקבות עומס חום.
Abstract
מטרת פרוטוקול זה היא לדמיין מוטות אקטין תוך-גרעיניים המתכנסים בעוברים חיים של דרוזופילה מלנוגאסטר בעקבות עומס חום. מוטות אקטין הם סימן היכר של תגובת מתח Actin שמורה ובלתי ניתנת להכנעה (ASR) המלווה פתולוגיות אנושיות, כולל מחלה נוירודגנרטיבית. בעבר, הראינו כי ASR תורם כשלים morphogenesis וכדאיות מופחתת של פיתוח עוברים. פרוטוקול זה מאפשר את המשך המחקר של מנגנונים שבבסיס הרכבת מוט actin ו ASR במערכת מודל כי הוא מאוד נוח הדמיה, גנטיקה וביוכימיה. עוברים נאספים ומורכבים על כיסוי כדי להכין אותם להזרקה. אקטין כדורי מצומד רודמין (G-actinאדום)מדולל וטעון לתוך microneedle. זריקה אחת נעשית למרכזו של כל עובר. לאחר ההזרקה, העוברים הם דגירה בטמפרטורה גבוהה מוטות actin תוך גרעיניים הם דמיינו לאחר מכן על ידי מיקרוסקופיה confocal. התאוששות פלואורסצנטית לאחר ניסויים photobleaching (FRAP) ניתן לבצע על מוטות actin; ומבנים אחרים עשירים באקטין בציטופלסמה יכולים גם הם להדמיינו. אנו מוצאים כי G-actinאדום polymerizes כמו G-actin אנדוגני ואינו, בכוחות עצמו, להפריע להתפתחות העובר נורמלי. מגבלה אחת של פרוטוקול זה היא כי יש לנקוט טיפול במהלך ההזרקה, כדי למנוע פגיעה חמורה בעובר. עם זאת, עם תרגול, הזרקת G-actinאדום לתוך עוברים Drosophila היא דרך מהירה ואמינה לדמיין מוטות actin והוא יכול לשמש בקלות עם זבובים של כל גנוטיפ או עם כניסתה של לחצים הסלולר אחרים, כולל היפוקסיה ומתח חמצוני.
Introduction
פרוטוקול זה מתאר כיצד להזריק G-actinאדום כדי לדמיין את ההרכבה של מוטות actin תוך גרעיני בעוברים לחוצים חום שעוברים תגובת מתח Actin בלתי ניתנת לערעור (ASR)1. פיתחנו פרוטוקול זה כדי לסייע במחקרים של ASR, אשר בעוברים מוביל מורפוגנזה משובשת וכדאיות מופחתת, ובסוגי תאים אנושיים בוגרים קשורה פתולוגיות כולל אי ספיקת כליות2, מיופתיות שרירים3, אלצהיימר ומחלת הנטינגטון4,5,6,7,8. זה ASR הוא המושרה על ידי לחצים תאיים רבים, כולל הלם חום9,10,11, מתח חמצוני4,6, סינתזת ATPמופחתת 12, ו האנטינטין חריג או אוליגומריזציה עמילואיד β4,5,6,7,9,13,14,15,16. סימן ההיכר של ASR הוא הרכבה של מוטות אקטין חריגים בציטופלסמה או בגרעין של תאים מושפעים, המונע על ידי היפראקטיביות הנגרמת על ידי מתח של חלבון אינטראקציה actin, Cofilin1,5,6,10. למרבה הצער, פערי ידע מרכזיים נשארים לגבי ASR. לדוגמה, הפונקציה של מוטות actin אינו ידוע. איננו מבינים מדוע מוטות נוצרים בציטופלסמה של סוגים מסוימים של תאים, אלא בגרעין של אחרים. כמו כן לא ברור אם ASR הוא מגן או לא מתאים עבור תאים או עוברים שעברו מתח. לבסוף, אנחנו עדיין לא יודעים את המנגנונים המפורטים שבבסיס היפראקטיביות Cofilin או הרכבה מוט actin. לפיכך, פרוטוקול זה מספק בדיקה מהירה ורב-תכליתית כדי לחקור את ASR על ידי הדמיה היווצרות מוט actin ודינמיקה במערכת ניסיונית ניתנת להפעלה מאוד של עובר זבוב הפירות החי.
הפרוטוקול כדי microinject G-actinאדום לתוך עוברים חיים Drosophila פותחה בתחילה כדי ללמוד את הדינמיקה של מבנים נורמליים cytoplasmic actin17 במהלך אירועי בניית רקמות. במחקרים אלה, מצאנו כיהזרקת אדום G-actin לא השפיעה לרעה על תהליכים התפתחותיים מוקדמים בעובר, כולל ציטוקינזיס או גסטריולציה17,18. לאחר מכן שינינו את הפרוטוקול, התאמת הטיפול בעוברוהזרקת אדום G-actin כדי לאפשר הדמיה של מוטות actin בחום עוברים ASR1. שיטות אחרות מלבדהזרקת אדום G-actin ניתן להשתמש כדי לדמיין actin בעוברים. שיטות אלה מסתמכות על ביטוי חלבונים פלואורסצנטיים (FPs) המתויגים לפעול או לתחומים של חלבונים מחייבים actin, כגון Utrophin-mCherry, Lifeact, F-tractin-GFP, ו Moesin-GFP (נבדק בשנת19). עם זאת, באמצעות בדיקות FP אלה דורש זהירות כי הם יכולים לייצב או לשבש כמה מבנים actin, לא באותה מידה תווית כל מבני actin20, ובמקרה של actin-GFP, הם מוגזמים מאוד – בעייתי לניתוח של הרכבת מוט אשר לא רק תלוי מתח אלא גם actin ריכוז תלוי1. לכן, G-actinאדום הוא החללית המועדפת על מחקרי מוט בעוברים לעוף, ואת הגודל הגדול של העובר מאפשר הזרקה קלה שלה.
זרימת העבודה של פרוטוקול זה דומה לטכניקות microinjection מבוססות אחרות ששימשו להזרקת חלבונים, חומצות גרעין, תרופות, אינדיקטורים פלואורסצנטיים לתוך עוברי Drosophila 21,22,23,24,25,26,27. עם זאת, בעקבות microinjection של אדום G-actin כאן, עוברים נחשפים ללחץ חום קל כדי לגרום ASR והרכבה מוט actin תוך-גרעיני. עבור מעבדות עם גישה זבובים אסדת הזרקה, שיטה זו צריכה להיות מיושמת בקלות להתאמה עבור קווי לימוד ספציפיים לגבי ASR, כולל אינדוקציה שלה על ידי לחצים שונים או אפנון ברקעים גנטיים שונים.
Protocol
Representative Results
Discussion
משמעותה של שיטה זו היא שהיא משתמשת בפרוטוקול מבוסס היטב של microinjection בעוברים Drosophila 21,22,23,24,25,26,27 כדי לאפשר מחקר חדש לגבי ASR וליווי הרכבת מוט actin. היתרון העיקרי ש?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים בהכרת תודה על עבודתם של ליוליו ז’נג וזנגווי שו, שעזרו לחלוץ טכניקה זו במעבדת סוקאק, כמו גם חסן סד שעזר בניתוח. העבודה למחקר זה ממומנת על ידי מענק מ- NIH (R01 GM115111).
Materials
| Adenosine triphosphate (ATP) | Millipore-Sigma | A23835G | Component of G buffer |
| Apple juice, Mott's, 64 fl oz | Mott's | 014800000344 | Component of apple juice plates |
| Bacto Agar | BD | 214010 | Component of apple juice plates |
| Bleach, PureBright Germicidal, 6.0% sodium hypochlorite | KIK International | 059647210020 | For dechorionating embryos |
| Calcium chloride | Millipore-Sigma | C1016500G | Component of G buffer |
| Cell strainer, 70 μm | Falcon | 352350 | For collecting dechorionated embryos |
| Confocal microscope, LSM 880 34-channel with Airyscan | Zeiss | 0000001994956 | For imaging intranuclear actin rods |
| Desiccant | Drierite | 24001 | For desiccating embryos |
| Dissecting microscope, Stemi 508 Stereoscope with 8:1 zoom | Zeiss | 4350649000000 | For arranging embryos on agar wedge |
| Dissecting needle, 5 in | Fisher Scientific | 08965A | For arranging embryos on agar wedge |
| Dithiothreitol (DTT) | Fisher Scientific | BP1725 | Component of G buffer |
| Double-sided Tape, Scotch Permanent, 0.5 in x 250 in | 3M | 021200010323 | For making embryo glue |
| Embryo collection cage | Genessee Scientific | 59100 | For housing adult flies and collecting embryos |
| Fine tip tweezers, Dumont Tweezer, Style 5 | Electron Microscopy Sciences | 72701D | For arranging embryos on agar wedge |
| Glass capillaries, Borosillicate glass, thin 1 mm x 0.75 mm | World Precision Instruments, Inc. | TW1004 | For microneedles |
| Halocarbon oil 27 | Millipore-Sigma | H8773100ML | For hydration of embryos |
| Heated stage incubator | Zeiss | 4118579020000, 4118609020000, 4118609010000 | For confocal imaging |
| Lab Tissue Wipers, KimWipes | Kimberly-Clark | 34155 | Lab tissue wipers |
| Light microscope, Invertoskop 40C Inverted Phase contrast microscope, refurbished | Zeiss | Discontinued | Injection microscope |
| Methyl-4-hydroxybenzoate | Millipore-Sigma | H36471KG | Component of apple juice plates |
| Microinjector, FemtoJet4x | Eppendorf | 5253000025 | Microinjector |
| Micro loader tips, epT.I.P.S. 20 μL | Eppendorf | 5242956003 | For loading microneedles |
| Micromanipulator and injection stage with x,y,z dials for needle adjustment | Bernard Instruments, Inc (Houston, TX) | Custom | For performing microinjections |
| Micropipette puller, Model P-97, Flaming/Brown | Sutter Instruments | P97 | For pulling capillary tubes to make microneedles |
| Microscope cover glass 24×50-1.5 | Fisher Scientific | 12544E | For mounting embryos |
| Microscope slides, Lilac Colorfrost, Precleaned, 25 x 75 x 1mm | Fisher Scientific | 22037081 | For mounting embryos for injection |
| n-Heptane | Fisher Scientific | H3601 | Component of embryo glue |
| Objective, 10x | Zeiss | Discontinued | 10x objective for injection microscope |
| Objective, C-Apochromat 40x/1,2 W Korr. FCS | Zeiss | 4217679971711 | 40x water objective for confocal |
| Objective, LD LCI Plan-Apochromat 25x/0.8 Imm Cor DIC M27 for oil, water, silicone oil or glycerine immersion (D=0-0.17mm) (WD=0.57mm at D=0.17mm) | Zeiss | 4208529871000 | 25x mixed immersion objective for confocal |
| Objective, Plan-Apocrhomat 63x/1.40 Oil DIC f/ELYRA | Zeiss | 4207829900799 | 63x oil objective for confocal |
| Paintbrush, Robert Simmons Expression E85 Pointed Round size 2 | Daler-Rowney | 038372016954 | For transferring embryos |
| Paper towels, Kleenex C-fold paper towels, white | Kimberly-Clark | 884266344845 | For blotting cell strainer |
| Pasteur pipette, 5 3/4 in | Fisher Scientific | 1367820A | For covering embryos with oil |
| Petri dish, glass, 100 x 20 mm | Corning | 3160102 | For humid incubation chamber |
| Petri dish, plastic, 60 x 15 mm | VWR | 25384092 | For apple juice plates |
| Pipette, Eppendorf Reference 0.5-10 μL | Eppendorf | 2231000604 | For loading the microneedle |
| Pipette tip, xTIP4 250 μL | Biotix | 63300006 | For adding embryo glue to coverslip |
| Razor blade | VWR | 55411050 | For cutting agar wedge, tape, pipette tips |
| Rhodamine-conjugated globular actin, human platelet (non-muscle; 4×10 μg) | Cytoskeleton, Inc. | APHR-A | G-actin^Red |
| Scintillation vial, 20 mL Glass borosillicate with polyethylene liner and urea caps | Fisher Scientific | 033377 | For making embryo glue |
| Screw top jar, 16 oz | Nalgene | 000194414195 | For desiccating embryos |
| Stage micrometer | Electron Microscopy Sciences | 602104PG | For calibrating volume of G-actin injection |
| Sucrose | Millipore-Sigma | 840971KG | Component of apple juice plates |
| Trizma base | Millipore-Sigma | T15031KG | Component of G buffer |
| Yeast, Lesaffre Yeast Corporation Yeast, Red Star Active Dry, 32 oz | Lesaffre Yeast Corporation | 117929157002 | Component of yeast paste |
References
- Figard, L., et al. Cofilin-mediated Actin Stress Response is maladaptive in heat-stressed embryos. Cell Reports. 26 (49), 3493-3501 (2019).
- Ashworth, S. L., et al. ADF/cofilin mediates actin cytoskeletal alterations in LLC-PK cells during ATP depletion. American Journal of Physiology Renal Physiology. 284 (4), 852-862 (2003).
- Vandebrouck, A., et al. In vitro analysis of rod composition and actin dynamics in inherited myopathies. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 69 (5), 429-441 (2010).
- Minamide, L. S., Striegl, A. M., Boyle, J. A., Meberg, P. J., Bamburg, J. R. Neurodegenerative stimuli induce persistent ADF/cofilin-actin rods that disrupt distal neurite function. Nature Cell Biology. 2 (9), 628-636 (2000).
- Bamburg, J. R., et al. ADF/Cofilin-actin rods in neurodegenerative diseases. Current Alzheimer Research. 7 (3), 241-250 (2010).
- Bamburg, J. R., Bernstein, B. W. Actin dynamics and cofilin-actin rods in alzheimer disease. Cytoskeleton. 73 (9), 477-497 (2016).
- Bernstein, B. W., Chen, H., Boyle, J. A., Bamburg, J. R. Formation of actin-ADF/cofilin rods transiently retards decline of mitochondrial potential and ATP in stressed neurons. AJP: Cell Physiology. 291 (5), 828-839 (2006).
- Munsie, L. N., Desmond, C. R., Truant, R. Cofilin nuclear-cytoplasmic shuttling affects cofilin-actin rod formation during stress. Journal of Cell Science. 125 (17), 3977-3988 (2012).
- Iida, K., Iida, H., Yahara, I. Heat shock induction of intranuclear actin rods in cultured mammalian cells. Experimental Cell Research. 165, 207-215 (1986).
- Ohta, Y., Nishida, E., Sakai, H., Miyamoto, E. Dephosphorylation of cofilin accompanies heat shock-induced nuclear accumulation of cofilin. Journal of Biological Chemistry. 264 (27), 16143-16148 (1989).
- Iida, K., Matsumoto, S., Yahara, I. The KKRKK sequence is involved in heat shock-induced nuclear translocation of the 18-kDa actin-binding protein, cofilin. Cell Structure and Function. 17 (1), 39-46 (1992).
- Minamide, L. S., et al. Isolation and characterization of cytoplasmic cofilin-actin rods. Journal of Biological Chemistry. 285 (8), 5450-5460 (2010).
- Masurovsky, E. B., Benitez, H. H., Kim, S. U., Murray, M. R. Origin, development, and nature of intranuclear rodlets and associated bodies in chicken sympathetic neurons. The Journal of Cell Biology. 44 (7), 172-191 (1970).
- Feldman, M. L., Peters, A. Intranuclear rods and sheets in rat cochlear nucleus. Journal of Neurocytology. 1 (2), 109-127 (1972).
- Nishida, E., et al. Cofilin is a component of intranuclear and cytoplasmic actin rods induced in cultured cells. Cell Biology. 84 (8), 5262-5266 (1987).
- Ono, S., Abe, H., Nagaoka, R., Obinata, T. Colocalization of ADF and cofilin in intranuclear actin rods of cultured muscle cells. Journal of Muscle Research and Cell Motility. 14 (2), 195-204 (1993).
- Xue, Z., Sokac, A. M. Back-to-back mechanisms drive actomyosin ring closure during Drosophila embryo cleavage. The Journal of Cell Biology. 215 (3), 335-344 (2016).
- Cao, J., Albertson, R., Riggs, B., Field, C. M., Sullivan, W. Nuf, a Rab11 effector, maintains cytokinetic furrow integrity by promoting local actin polymerization. Journal of Cell Biology. 182 (2), 301-313 (2008).
- Spracklen, A. J., Fagan, T. N., Lovander, K. E., Tootle, T. L. The pros and cons of common actin labeling tools for visualizing actin dynamics during Drosophila oogenesis. Developmental Biology. 393 (2), 209-226 (2014).
- Chen, Q., Nag, S., Pollard, T. D. Formins filter modified actin subunits during processive elongation. Journal of Structural Biology. 177 (1), 32-39 (2012).
- Iordanou, E., Chandran, R. R., Blackstone, N., Jiang, L. RNAi interference by dsRNA injection into Drosophila embryos. Journal of Visualized Experiments. (50), 2477 (2011).
- Juarez, M. T., Patterson, R. A., Li, W., McGinnis, W. Microinjection wound assay and in vivo localization of epidermal wound response reporters in Drosophila embryos. Journal of Visualized Experiments. 81, 50750 (2013).
- Carreira-Rosario, A., et al. Recombineering homologous recombination constructs in Drosophila. Journal of Visualized Experiments. (77), 50346 (2013).
- Brust-Mascher, I., Scholey, J. M. Microinjection techniques for studying mitosis in the Drosophila melanogaster syncytial embryo. Journal of Visualized Experiments. (31), 1382 (2009).
- Catrina, I. E., Bayer, L. V., Omar, O. S., Bratu, D. P. Visualizing and tracking endogenous mRNAs in live Drosophila melanogaster egg chambers. Journal of Visualized Experiments. (148), 58545 (2019).
- Wessel, A. D., Gumalla, M., Grosshans, J., Schmidt, C. F. The mechanical properties of early Drosophila embryos measured by high-speed video microrheology. Biophysical Journal. 108 (8), 1899-1907 (2015).
- Mollinari, C., González, A., Cid-Arregui, A., García-Carrancá, Microinjection and transgenesis. Microinjection and Transgenesis: Strategies and Protocols. , 587-603 (1998).
- Figard, L., Sokac, A. M. Imaging cell shape change in living Drosophila embryos. Journal of Visualized Experiments. (49), 2503 (2011).
- Oesterle, A. . Pipette Cookbook 2018: P-97 and P-1000 Micropipette Pullers. , (2018).
- Bownes, M. A photographic study of development in the living embryo of Drosophila melanogaster. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 33 (3), 789-801 (1975).
- Powsner, L. The effects of temperature on the durations of the developmental stages of Drosophila melanogaster. Physiological Zoology. 8 (4), 474-520 (1935).
- Hunter, M. V., Willoughby, P. M., Bruce, A. E. E., Fernandez-Gonzalez, R. Oxidative Stress Orchestrates Cell Polarity to Promote Embryonic Wound Healing. Developmental Cell. 47 (3), 377-387 (2018).
