Imaging Intranuclear Actin Rods in Live Heat Stressed Drosophila Embryos
Summary
Das Ziel dieses Protokolls ist es, Rhodamine-konjugiertes Kugelaktin in Drosophila-Embryonen zu injizieren und die intranukleare Aktinstabsmontage nach Hitzestress abzubilden.
Abstract
Der Zweck dieses Protokolls ist es, intranukleare Aktinstäbe zu visualisieren, die sich in lebenden Drosophila melanogaster Embryonen nach Hitzestress zusammensetzen. Actin-Stäbe sind ein Kennzeichen einer konservierten, induktiven Actin Stress Response (ASR), die menschliche Pathologien begleitet, einschließlich neurodegenerativer Erkrankungen. Zuvor haben wir gezeigt, dass die ASR zu Morphogenese-Ausfällen und einer verminderten Lebensfähigkeit der sich entwickelnden Embryonen beiträgt. Dieses Protokoll ermöglicht die kontinuierliche Untersuchung der Mechanismen, die der Aktinstabbaugruppe und der ASR in einem Modellsystem zugrunde liegen, das sehr bildgebend, genetisch und biochemie geeignet ist. Embryonen werden gesammelt und auf einem Deckslip montiert, um sie für die Injektion vorzubereiten. Rhodamine-konjugiertes Kugelaktin (G-ActinRed) wird verdünnt und in eine Mikronadel geladen. Eine einzige Injektion erfolgt in das Zentrum jedes Embryos. Nach der Injektion werden Embryonen bei erhöhter Temperatur inkubiert und intranukleare Aktinstäbe werden dann durch konfokale Mikroskopie visualisiert. Fluoreszenzrückgewinnung nach Photobleichung (FRAP) Experimente können an den Aktinstäben durchgeführt werden; und andere aktinreiche Strukturen im Zytoplasma können ebenfalls abgebildet werden. Wir stellen fest, dass G-ActinRed wie endogenes G-Actin polymerisiert und allein nicht die normale Embryoentwicklung beeinträchtigt. Eine Einschränkung dieses Protokolls besteht darin, dass während der Injektion Vorsicht geboten ist, um eine schwere Verletzung des Embryos zu vermeiden. Jedoch, mit der Praxis, Injektion von G-ActinRot in Drosophila Embryonen ist eine schnelle und zuverlässige Möglichkeit, Aktin-Stäbe zu visualisieren und kann leicht mit Fliegen jeder Art oder mit der Einführung von anderen zellulären Spannungen verwendet werden, einschließlich Hypoxie und oxidativen Stress.
Introduction
Dieses Protokoll beschreibt, wie Man G-ActinRed injizieren, um die Montage von intranuklearen Aktinstäben in wärmebelasteten Embryonen zu visualisieren, die sich einer induzierbaren Actin-Stressreaktion (ASR)1unterziehen. Wir entwickelten dieses Protokoll, um Studien der ASR zu unterstützen, die bei Embryonen zu gestörter Morphogenese und verminderter Lebensfähigkeit führt, und bei erwachsenen menschlichen Zelltypen ist mit Pathologien wie Nierenversagen2, Muskelmyopathien3und Alzheimer und Huntington4,5,6,7,8verbunden. Dieser ASR wird durch zahlreiche zelluläre Spannungen induziert, einschließlich Hitzeschock9,10,11, oxidativer Stress4,6, reduzierte ATP-Synthese12, und abnormale Huntingtin oder β-Amyloid-Oligomerisierung4,5,6,7,9,13,14,15,16. Ein Markenzeichen der ASR ist die Montage von abnormen Aktinstäben im Zytoplasma oder Kern der betroffenen Zellen, die durch stressinduzierte Hyperaktivierung eines Aktin-interagierenden Proteins, Cofilin1,5,6,10angetrieben wird. Leider bestehen nach wie vor wesentliche Wissenslücken in Bezug auf die ASR. Beispielsweise ist die Funktion der Aktinstäbe nicht bekannt. Wir verstehen nicht, warum Sichstäbe im Zytoplasma einiger Zelltypen bilden, aber der Kern anderer. Es ist auch nicht klar, ob die ASR für Zellen oder Embryonen, die sich stressfähig befinden, schützend oder maladaptiv ist. Schließlich kennen wir immer noch nicht die detaillierten Mechanismen, die der Cofilin-Hyperaktivierung oder Aktinstab-Montage zugrunde liegen. Somit bietet dieses Protokoll einen schnellen und vielseitigen Test zur Untersuchung des ASR, indem es die Aktinstabbildung und -dynamik im hochgradig beziehbaren Versuchssystem des lebenden Fruchtfliegenembryons visualisiert.
Das Protokoll zur Mikroinjektion von G-ActinRed in lebende Drosophila-Embryonen wurde ursprünglich entwickelt, um die Dynamik normaler zytoplasmatischer Aktinstrukturen17 während gewebebildender Ereignisse zu untersuchen. In diesen Studien fanden wir heraus, dass die G-Actin-Rot-Injektion die frühen Entwicklungsprozesse im Embryo, einschließlich Zytokinese oder Gastrulation17, 18, nicht beeinträchtigte. Wir modifizierten dann das Protokoll, passten die Embryo-Handhabung und G-ActinRed Injektion an, um die Bildgebung von Aktinstäben in wärmebelasteten Embryonen zu ermöglichen, die sich dem ASR1unterziehen. Andere Methoden neben G-ActinRote Injektion kann verwendet werden, um Actin in Embryonen zu visualisieren. Diese Methoden basieren auf der Exdinsiz fluoreszierender Proteine (FPs), die mit Actin oder Domänen von Actin-bindenden Proteinen wie Utrophin-mCherry, Lifeact, F-tractin-GFP und Moesin-GFP (rezensiert in19) markiert sind. Die Verwendung dieser FP-Sonden erfordert jedoch Vorsicht, da sie einige Aktinstrukturen stabilisieren oder stören können, nicht alle Aktinstrukturen20gleich kennzeichnen und im Falle von Actin-GFP stark überexprimiert werden – problematisch für die Analyse der Stabmontage, die nicht nur stressabhängig, sondern auch aktinkonzentrationsabhängigist 1. Somit ist G-ActinRed die bevorzugte Sonde für Stabstudien an Fliegenembryonen, und die große Größe des Embryos ermöglicht seine einfache Injektion.
Der Arbeitsablauf dieses Protokolls ähnelt anderen etablierten Mikroinjektionstechniken, die zur Injektion von Proteinen, Nukleinsäuren, Medikamenten und fluoreszierenden Indikatoren in Drosophila-Embryonen 21,22,23,24,25,26,27verwendet wurden. Nach der Mikroinjektion von G-ActinRed sind Embryonen jedoch leichtem Hitzestress ausgesetzt, um die ASR- und intranukleare Aktinstab-Montage zu induzieren. Für Labore mit Zugang zu Fliegen und einem Injektionssystem sollte diese Methode für bestimmte Studienlinien in Bezug auf die ASR leicht umsetzbar und anpassungsfähig sein, einschließlich ihrer Induktion durch unterschiedliche Spannungen oder Modulation in unterschiedlichen genetischen Hintergründen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Bedeutung dieser Methode ist, dass sie das etablierte Protokoll der Mikroinjektion in Drosophila-Embryonen 21,22,23,24,25,26,27 nutzt, um neue Forschungen in Bezug auf die ASR und die begleitende Aktinstabmontage zu ermöglichen. Ein großer Vorteil der Injektion von G-Actin<sup…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren würdigen die Arbeit von Liuliu Zheng und Zenghui Xue, die diese Technik im Sokac-Labor mitvorangetrieben haben, sowie Hasan Seede, der bei der Analyse mitgeholfen hat. Die Arbeit für diese Studie wird durch ein Stipendium des NIH (R01 GM115111) finanziert.
Materials
| Adenosine triphosphate (ATP) | Millipore-Sigma | A23835G | Component of G buffer |
| Apple juice, Mott's, 64 fl oz | Mott's | 014800000344 | Component of apple juice plates |
| Bacto Agar | BD | 214010 | Component of apple juice plates |
| Bleach, PureBright Germicidal, 6.0% sodium hypochlorite | KIK International | 059647210020 | For dechorionating embryos |
| Calcium chloride | Millipore-Sigma | C1016500G | Component of G buffer |
| Cell strainer, 70 μm | Falcon | 352350 | For collecting dechorionated embryos |
| Confocal microscope, LSM 880 34-channel with Airyscan | Zeiss | 0000001994956 | For imaging intranuclear actin rods |
| Desiccant | Drierite | 24001 | For desiccating embryos |
| Dissecting microscope, Stemi 508 Stereoscope with 8:1 zoom | Zeiss | 4350649000000 | For arranging embryos on agar wedge |
| Dissecting needle, 5 in | Fisher Scientific | 08965A | For arranging embryos on agar wedge |
| Dithiothreitol (DTT) | Fisher Scientific | BP1725 | Component of G buffer |
| Double-sided Tape, Scotch Permanent, 0.5 in x 250 in | 3M | 021200010323 | For making embryo glue |
| Embryo collection cage | Genessee Scientific | 59100 | For housing adult flies and collecting embryos |
| Fine tip tweezers, Dumont Tweezer, Style 5 | Electron Microscopy Sciences | 72701D | For arranging embryos on agar wedge |
| Glass capillaries, Borosillicate glass, thin 1 mm x 0.75 mm | World Precision Instruments, Inc. | TW1004 | For microneedles |
| Halocarbon oil 27 | Millipore-Sigma | H8773100ML | For hydration of embryos |
| Heated stage incubator | Zeiss | 4118579020000, 4118609020000, 4118609010000 | For confocal imaging |
| Lab Tissue Wipers, KimWipes | Kimberly-Clark | 34155 | Lab tissue wipers |
| Light microscope, Invertoskop 40C Inverted Phase contrast microscope, refurbished | Zeiss | Discontinued | Injection microscope |
| Methyl-4-hydroxybenzoate | Millipore-Sigma | H36471KG | Component of apple juice plates |
| Microinjector, FemtoJet4x | Eppendorf | 5253000025 | Microinjector |
| Micro loader tips, epT.I.P.S. 20 μL | Eppendorf | 5242956003 | For loading microneedles |
| Micromanipulator and injection stage with x,y,z dials for needle adjustment | Bernard Instruments, Inc (Houston, TX) | Custom | For performing microinjections |
| Micropipette puller, Model P-97, Flaming/Brown | Sutter Instruments | P97 | For pulling capillary tubes to make microneedles |
| Microscope cover glass 24×50-1.5 | Fisher Scientific | 12544E | For mounting embryos |
| Microscope slides, Lilac Colorfrost, Precleaned, 25 x 75 x 1mm | Fisher Scientific | 22037081 | For mounting embryos for injection |
| n-Heptane | Fisher Scientific | H3601 | Component of embryo glue |
| Objective, 10x | Zeiss | Discontinued | 10x objective for injection microscope |
| Objective, C-Apochromat 40x/1,2 W Korr. FCS | Zeiss | 4217679971711 | 40x water objective for confocal |
| Objective, LD LCI Plan-Apochromat 25x/0.8 Imm Cor DIC M27 for oil, water, silicone oil or glycerine immersion (D=0-0.17mm) (WD=0.57mm at D=0.17mm) | Zeiss | 4208529871000 | 25x mixed immersion objective for confocal |
| Objective, Plan-Apocrhomat 63x/1.40 Oil DIC f/ELYRA | Zeiss | 4207829900799 | 63x oil objective for confocal |
| Paintbrush, Robert Simmons Expression E85 Pointed Round size 2 | Daler-Rowney | 038372016954 | For transferring embryos |
| Paper towels, Kleenex C-fold paper towels, white | Kimberly-Clark | 884266344845 | For blotting cell strainer |
| Pasteur pipette, 5 3/4 in | Fisher Scientific | 1367820A | For covering embryos with oil |
| Petri dish, glass, 100 x 20 mm | Corning | 3160102 | For humid incubation chamber |
| Petri dish, plastic, 60 x 15 mm | VWR | 25384092 | For apple juice plates |
| Pipette, Eppendorf Reference 0.5-10 μL | Eppendorf | 2231000604 | For loading the microneedle |
| Pipette tip, xTIP4 250 μL | Biotix | 63300006 | For adding embryo glue to coverslip |
| Razor blade | VWR | 55411050 | For cutting agar wedge, tape, pipette tips |
| Rhodamine-conjugated globular actin, human platelet (non-muscle; 4×10 μg) | Cytoskeleton, Inc. | APHR-A | G-actin^Red |
| Scintillation vial, 20 mL Glass borosillicate with polyethylene liner and urea caps | Fisher Scientific | 033377 | For making embryo glue |
| Screw top jar, 16 oz | Nalgene | 000194414195 | For desiccating embryos |
| Stage micrometer | Electron Microscopy Sciences | 602104PG | For calibrating volume of G-actin injection |
| Sucrose | Millipore-Sigma | 840971KG | Component of apple juice plates |
| Trizma base | Millipore-Sigma | T15031KG | Component of G buffer |
| Yeast, Lesaffre Yeast Corporation Yeast, Red Star Active Dry, 32 oz | Lesaffre Yeast Corporation | 117929157002 | Component of yeast paste |
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