Beeldvorming Intranucleaire Actin Staven in Live Heat Stressed Drosophila Embryo's

Dit protocol beschrijft hoe G-actine^Rood te injecteren om de assemblage van intranucleaire actine staven in hitte-gestresste embryo’s die een induceerbare Actin Stress Response (ASR)^{ondergaan visualiseren 1}. We ontwikkelden dit protocol ter ondersteuning van studies van de ASR, die in embryo’s leidt tot verstoorde morfogenese en verminderde levensvatbaarheid, en bij volwassen menselijke celtypen wordt geassocieerd met pathologieën zoals nierfalen², spier myopathieën³, en Alzheimer en De Ziekte van Huntington^4,5,6,7,8. Deze ASR wordt veroorzaakt door talrijke cellulaire spanningen, waaronder hitteschok^9,10,11,oxidatieve stress^4,6, verminderde ATP-synthese¹², en abnormale Huntingtine of β-amyloïde oligomerisatie^{4,5,6,7,9,13,14,15,16}. Een kenmerk van de ASR is de assemblage van afwijkende actinestaven in het cytoplasma of de kern van aangetaste cellen, die wordt aangedreven door stress-geïnduceerde hyperactivatie van een actine interacterend eiwit, Cofilin^1,5,6,10. Helaas blijven er belangrijke kennislacunes bestaan met betrekking tot de ASR. De functie van de actinestaven is bijvoorbeeld niet bekend. We begrijpen niet waarom staven zich vormen in het cytoplasma van sommige celtypen, maar de kern van anderen. Het is ook niet duidelijk of de ASR beschermend of onaantastelijk is voor cellen of embryo’s die stress ervaren. Tot slot kennen we nog steeds niet de gedetailleerde mechanismen die ten grondslag liggen aan Cofilin hyperactivatie of actine staafassemblage. Dit protocol biedt dus een snelle en veelzijdige test om de ASR te onderzoeken door actine staafvorming en dynamiek in het zeer tracteerbare experimentele systeem van het levende fruitvliegembryo te visualiseren.

Het protocol om G-actine^Red te micro-injecteren in levende Drosophila-embryo’s werd aanvankelijk ontwikkeld om de dynamiek van normale cytoplasmatische actinestructuren¹⁷ te bestuderen tijdens weefselopbouwgebeurtenissen. In die studies ontdekten we dat G-actine^Rode injectie geen negatieve invloed had op vroege ontwikkelingsprocessen in het embryo, waaronder cytokinese of gastrulatie^17,18. Vervolgens hebben we het protocol gewijzigd, waarbij we de embryobehandeling en G-actine^Red-injectie hebben aangepast om beeldvorming van actinestaven in hittebelaste embryo’s die de ASR¹ondergaan mogelijk te maken. Andere methoden naast G-actine^Rode injectie kunnen worden gebruikt om actine in embryo’s te visualiseren. Deze methoden zijn gebaseerd op het uitdrukken van fluorescerende eiwitten (FPs) die zijn getagd op actine of op domeinen van actinebindende eiwitten, zoals Utrophin-mCherry, Lifeact, F-tractin-GFP en Moesin-GFP (herzien in¹⁹). Het gebruik van deze FP-sondes vereist echter voorzichtigheid, omdat ze sommige actinestructuren kunnen stabiliseren of verstoren, niet alle actinestructuren gelijk labelen²⁰, en in het geval van actin-GFP, zeer overexpressie hebben – problematisch voor de analyse van staafassemblage die niet alleen stressafhankelijk is, maar ook actineconcentratieafhankelijk¹. Zo is G-actin^Red de voorkeursonde voor staafstudies in vliegenembryo’s, en de grote omvang van het embryo maakt de eenvoudige injectie mogelijk.

De workflow van dit protocol is vergelijkbaar met andere gevestigde micro-injectietechnieken die zijn gebruikt voor het injecteren van eiwitten, nucleïnezuren, geneesmiddelen en fluorescerende indicatoren in Drosophila-embryo ‘s^{21,22,23,24,25,26,27}. Echter, na de micro-injectie van G-actine^Rood hier, embryo’s worden blootgesteld aan milde hitte stress om de ASR en intranucleaire actine staaf assemblage te induceren. Voor laboratoria met toegang tot vliegen en een injectieplatform moet deze methode gemakkelijk uitvoerbaar en aanpasbaar zijn voor specifieke studielijnen met betrekking tot de ASR, met inbegrip van de inductie ervan door verschillende spanningen of modulatie in verschillende genetische achtergronden.