Pré-concentração baseada em papel e isolamento de microvesículos e exosóis
Summary
Apresentado é um protocolo para fabricar um dispositivo baseado em papel para o enriquecimento efetivo e isolamento de microvesículos e exosóis.
Abstract
Microvesículos e exosóis são pequenas vesículas membranous liberadas para o ambiente extracelular e circuladas por todo o corpo. Por conterem várias biomoléculas derivadas de células parentais, como DNA, mRNA, miRNA, proteínas e lipídios, seu enriquecimento e isolamento são passos críticos para sua exploração como potenciais biomarcadores para aplicações clínicas. No entanto, métodos convencionais de isolamento (por exemplo, ultracentrifugação) causam perdas e danos significativos a microvesculas e exosóis. Esses métodos também requerem múltiplas etapas repetitivas de ultracentrifugação, carregamento e desolação de reagentes. Este artigo descreve um método detalhado para fabricar um dispositivo baseado em papel origami (Exo-PAD) projetado para o enriquecimento efetivo e isolamento de microvesículos e exosóis de forma simples. O design único do Exo-PAD, composto por camadas multi-dobradas semelhantes a acordeões com áreas de amostra convergentes, é integrado à técnica de polarização da concentração de íons, permitindo assim o enriquecimento de cinco vezes dos microvesículos e exosóis em camadas específicas. Além disso, os microvesículos enriquecidos e exosóis são isolados simplesmente desdobrando o Exo-PAD.
Introduction
Microvesículos e exosóis são pequenas vesículas de membrana medindo 0,2−1 μm e 30-200 nm, respectivamente. Eles são secretados no ambiente extracelular por vários tipos diferentes de células1,,2,,3,,4,5. Eles contêm informações de células parentais na forma de subconjuntos de DNA, mRNA, miRNA, proteínas e lipídios, e circulam por todo o corpo através de vários fluidos corporais, como soro, plasma, urina, fluido cefalorraquidiano, fluido amniótico e saliva6,,7,,8,,9. Assim, técnicas de isolamento eficiente de microvesículos e exosóis de fluidos biológicos podem proporcionar amplas oportunidades nas áreas do diagnóstico, prognóstico e monitoramento em tempo real da doença, bem como no desenvolvimento de novas terapêuticas.
No entanto, o método de isolamento convencional para microvesículos e exosóis baseados na ultracentrifugação é extremamente demorado e causa perda e contaminação significativas da amostra. Isso porque envolve várias etapas de tubulação e carregamento e descarte de vários reagentes com ultracentrifugação repetida5,6,,10,,11,12. Além disso, o alto estresse de corte induzido pela ultracentrifugação (~100.000 x g) pode causar a lise física de microvesículos e exosóis, gerando baixas taxas de recuperação (5-23%)6,13,14. Portanto, uma técnica de isolamento altamente eficiente e discreta para microvesculas e exosóis deve ser desenvolvida para reduzir danos e perdas, alcançando assim taxas de recuperação mais elevadas.
Um dispositivo à base de papel origami (Exo-PAD) foi desenvolvido para um isolamento mais simples, suave e altamente eficiente de microvesículos e exosóis6. O design do Exo-PAD é um papel multi-dobrado com áreas de amostra conectadas em série que gradualmente diminuem de diâmetro. A técnica de polarização da concentração de íons (ICP), que é um fenômeno nano-eletrocinético que pré-concentra biomoléculas carregadas, foi integrada a este design único. O uso do Exo-PAD resultou em enriquecimento cinco vezes maior dos microvesículos e exosóis em camadas específicas e seu isolamento simplesmente desdobrando o dispositivo. Este artigo descreve o Exo-PAD em detalhes, desde a fabricação e operação geral do dispositivo até a análise de seu uso, para ilustrar o método e mostrar resultados representativos6.
Protocol
Representative Results
Discussion
Embora o Exo-PAD tenha sido utilizado com sucesso para o enriquecimento e isolamento de microvesculas e exosóis, vários pontos críticos devem ser cuidadosamente considerados: 1) o tempo de incubação do forno e a temperatura durante a preparação do dispositivo, 2) tempo de processamento, 3) aplicação de tensão com números de camadas variados e diâmetros da área da amostra, e 4) aplicabilidade às amostras clínicas.
O tempo de incubação e a temperatura dado no protocolo são cond…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudo foi apoiado pela Fundação Nacional de Pesquisa da Coreia, Grant NRF-2018R1D1A1A09084044. J. H. Lee foi apoiado por uma bolsa de pesquisa da Universidade Kwangwoon em 2019. Hyerin Kim foi apoiada pelo “Programa de Desenvolvimento de Competências para Especialistas da Indústria” do Ministério do Comércio, Indústria e Energia da Coreia (MOTIE), operado pelo Korea Institute for Advancement of Technology (KIAT) (No. P0002397, programa HRD para Convergência Industrial de Dispositivos Inteligentes Vestíveis).
Materials
| Ag/AgCl electrodes | A-M Systems, Inc. | 531500 | 0.15" diameter |
| Albumin from Bovine Serum (BSA), Alexa Fluor 594 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A13101 | BSA conjugated with Alexa Fluor 594 (Ex/Em: 590/617 nm) |
| Carbonate-Bicarbonate Buffer | Sigma-Aldrich | C3041-50CAP | Carbonate buffer |
| CorelDraw software (Coral Co., Canada) | Corel Corporation | Printer software to define wax printing region | |
| ColorQube 8870 | Xerox Corporation | Wax printer | |
| Chromatography paper grade 1 | Whatman | 3001-861 | Cellulose paper, dimension: 20 * 20 cm |
| Fluorescent-labeled exosome standards | HansaBioMed Life Sciences, Ltd. | HBM-F-PEP-100 | Exosome labeled with FITC (Ex/Em: 490/520 nm) |
| Keithley 2410 current/voltage source-meter | Keithley Instruments, Inc. | Current–voltage source measurement system | |
| Nafion perfluorinated resin solution | Sigma-Aldrich | 31175-20-9 | Permselective membrane, 20 wt.% in the mixture of lower aliphatic alcohols and water; contains 34% water |
| NanoSight LM10 | NanoSight Technology | Nanoparticle tracking analysis (NTA) machine | |
| Phosphate-buffered saline (PBS, pH7.4) | Thermo Fisher Scientific | 10010001 |
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